高温胁迫下匍匐翦股颖耐热突变体“粤选1号”能量水平研究

涂庆华，莫亿伟，陈 平

(1．江西抚州职业技术学院，江西抚州344000;2．绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴312000;3．仲恺农业工程学院园林园艺学院，广东广州510225)

冷季型草坪草的光合作用对高温胁迫非常敏感，维持较高的光合效率通常是草坪草抵抗热害的首要生存策略［1］，叶片光合色素吸收光能通过光反应后转化为光合力(ATP和NADPH)，叶绿体内ATP主要通过光合磷酸化产生，由类囊体膜上ATPase催化，因此ATPase活性对叶绿体内ATP合成起着决定作用;当叶绿体内ATP供应不足，直接导致RuBP合成受阻，使RuBPcase底物供应不足，从而降低叶片的光合效率［2-3］．ZHENG 等［4］指出，当小麦旗叶片受水分和盐胁迫时，叶绿体ATPase酶活性下降，叶片ATP含量显著减少，旗叶的光合速率降低，说明ATP供应能量与植物光合效率有密切关系［5］．

匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)是优良冷季型草坪草，被广泛应用于高尔夫球场果岭、球道和足球场等，但因耐热性差很难在华南地区安全越夏．陈平等［6-8］从匍匐翦股颖“Penncross”的营养体自然突变中筛选到耐热突变体“粤选1号”，其色泽、触感、繁殖能力等性状均优于亲本，经过多年的应用，在华南地区可终年常绿．“粤选1号”具有优良的耐热特性，耐热突变体的耐热机制与光合速率和叶片的ATP供应的关系不清楚．TEZARA等［2］认为:ATP供应不足导致了光合作用底物RuBP合成能力下降，使RuBPcase所需底物供应减少;还有一种可能是ATP供应不足导致RuBPcase活化量减少［9］．

本文以匍匐翦股颖耐热突变体“粤选1号”及亲本“Penncross”为研究材料，从叶片光合效率和能量代谢的关系进行分析，探讨高温胁迫下能量供应水平对光合作用的影响，为“粤选1号”大面积地推广提供理论依据．

1 材料与方法

“粤选1号”是从Penncross营养体自然突变筛选出来的耐热优良新品种(2004年12月通过国家品种审定，品种登记号288)．本研究的材料“粤选1号”及亲本Penncross均由陈平提供．

1．1 材料的培养和高温处理

栽培基质为泥炭土、菜园土、河沙，按质量比1∶1∶1混匀后装盆，取生长一致、健壮的“粤选1号”及亲本“Penncross”的长度为2～3 cm营养枝进行扦插，成活后自然光照，每周用1/2浓度的Hoagland营养液浇灌1次，以保证每盆有充足的营养供应．植株生长达到实验要求时，转到人工气候箱内，光照条件为14 h/10 h(昼/夜)，光强为500 ～800 μmol/(m2·S)，相对湿度为80% ～85%，温度为25℃/20℃(昼/夜)，经过3～5 d适应后，用35℃/30℃(昼/夜)高温处理，保持原来的湿度和光照周期．在处理0、12、24、36、48 h 后，随机选取生长一致第二片成熟叶片进行生理测定分析．

1．2 光合速率和光合放氧速率的测定

按照陈平等［6］的方法，用Li-6400法测定叶片光合速率;叶片光合放氧速率的测定参照莫亿伟等［10］用液相氧电极方法测定．在饱和光照和CO2浓度下，测定不同温度条件下叶片光合放氧速率．

1．3 叶绿体的分离与纯化及叶绿体ATPase活性的测定

叶绿体的提取参照芮琪等［11］的方法．差速离心，通过1 mol/L葡萄糖溶液离心后，得到初步纯化的叶绿体，用最适宜的Percoll浓度进行梯度离心，分离到完整率更高的叶绿体．用氧电极测定叶绿体的Hill反应结合荧光显微镜进行观察，保障完整率大于80%［11］．参照ZHENG 等［4］的方法测定叶绿体Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性．

1．4 叶片和叶绿体ATP、ADP和AMP含量的测定与能荷分析

参照YOICHI［12］的方法进行分析．取1 g鲜叶片加入6mL的预冷HClO4溶液(0．5mol/L)研磨混匀，在4℃下，低温离心(10 000 g/min)15 min;上清液用 0．5 mol/L 的 KOH 溶液调节 pH 至 6．8 ～7．0．再定容摇匀，0．45μm滤头过滤后上机检测．色谱柱为:Sepax Bio-C18(250 mm ×4．6 mm ID．5 m);流动相为150 mmol/L NaH2PO4和K2HPO4组成的缓冲液(pH 6．68)，流速是 1．0 mL/min，柱温是 30 ℃;紫外检测波长为259 nm，每次进样量为10μL．测定结果以每克鲜叶所含ATP、ADP、AMP的毫克计．

1．5 数据统计分析

所有实验重复3次，用平均值±标准差表示，利用SPSS 13．0软件对组间进行单因素差异性分析．

2 结果与分析

2．1 高温胁迫对“粤选1号”和亲本光合速率的影响

正常生长条件下，“粤选1号”和亲本叶片净光合速率之间无显著差异．高温胁迫处理后，亲本叶片的光合速率急剧下降，胁迫48 h时，比协迫处理前下降了42．17%，而“粤选1号”的光合速率只下降了33．07%(图1)，两者间的差异达显著水平(P≤0．05)．说明高温胁迫下，“粤选1号”叶片光合速率对高温胁迫有更强的耐性．

图1 高温胁迫对“粤选1号”和亲本叶片光合速率的影响Figure 1 Effect of high temperature stress on photosynthetic rate of“Yuexuan 1”and its parent leaves

2．2 高温胁迫对“粤选1号”和亲本叶片光合放氧速率的影响

高温胁迫前，“粤选1号”和亲本叶片光合放氧速率之间没有显著差异．高温胁迫后，亲本叶片的光合放氧速率急剧下降．当胁迫48 h时，比处理前下降了31．11%，而“粤选1号”叶片的光合速率只下降了21．21%(图2)，两者间差异达显著(P≤0．05)．说明高温胁迫下，“粤选1号”叶绿体PSII的光合放氧中心在高温胁迫下比亲本有更强的耐性，光合放氧速率受到影响较小．

图2 高温胁迫对“粤选1号”和亲本叶片光合放氧速率的影响Figure 2 Effects of high temperature stress on photosynthetic oxygen evolution rate of“Yuexuan 1”and its parent leaves

2．3 高温胁迫对“粤选1号”和亲本叶片 ATP、ADP、AMP及能荷变化影响

能量组分主要是由ATP、ADP和AMP组成．在高温胁迫处理前，“粤选1号”和亲本叶片ATP、ADP和AMP的含量没有显著差异．经高温胁迫处理的亲本叶片ATP和ADP含量急剧下降，处理48 h时，比处理前分别下降了39．05%和42．03%，而“粤选1号”叶片的光合速率下降了25．31%和21．36%(图3A、3B)，两者间差异显著(P≤0．05)．在高温胁迫处理期间，叶片的AMP不断增加，亲本增加更迅速(图3C)．

高温胁迫前，“粤选1号”及亲本EC值分别为0．72和0．71，没有明显差异，随着处理时间延长，亲本和“粤选1号”植株的能荷值EC值发生变化，48 h以后，“粤选1号”EC值高于亲本，两者差异显著(图3D)．

图3 高温胁迫对“粤选1号”和亲本叶片的ATP、ADP、AMP含量及能荷的影响Figure 3 Effects of high temperature stress on the contents of ATP，ADP and AMP，and energy charge values in the leaves of“Yuexuan 1”and its parent plants

2．4 高温胁迫对“粤选1号”和亲本叶绿体M g2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的影响

高温胁迫前，亲本和“粤选1号”叶绿体的Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性没有明显差异(图4)．处理48 h，亲本的Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性分别比处理前下降了 20．81%和42．06%，而“粤选1号”只分别下降了 14．67%和18．27%，说明“粤选1号”叶绿体在高温胁迫下，2种类型的ATPase活性有更强的耐高温性．

3 讨论

相关性分析发现，“粤选1号”叶片ATP含量与叶片光合速率相关性为 y=0．976x-1．524，R=0．969，表现出显著的正相关;同时，光合速率与能荷相关性为 y=27．997x-13．343，R2=0．981，说明“粤选1号”光合速率与能量供应密切相关，可能是“粤选1号”的光合速率在高温胁迫过程中高于亲本的原因之一．

图4 高温胁迫对“粤选1号”和亲本的Mg2+-ATPase及Ca2+-ATPase活性的影响Figure 4 Effects of high temperature stress on Mg2+-ATPase and Ca2+-ATPase activities in“Yuexuan 1”and the parent plants

高温胁迫条件下，“粤选1号”叶片能保持较高ATP和ADP含量，并维持较高的能荷参数;而亲本的ATP、ADP含量及能荷水平明显降低．相关性分析也表明，叶片光合速率大小与ATP含量和能荷均有着正相关，能量供应水平下降时，直接影响叶片的光合速率．这与前人对其他物种的研究结果相一致［3，5］．说明能量供应量是决定“粤选1号”和亲本光合速率差异的原因之一．实验结果还表明，高温下，“粤选1号”叶绿体ATPase的活性均比亲本高，高活性ATPase保证ATP顺利合成，从而有充足的能量供给暗反应，ATP供应能力下降，必然影响叶片光合效率．因此，在高温胁迫下，“粤选1号”叶绿体保持高活性的ATPase，才能保证ATP顺利合成与供应，维持高效的光合作用．

高温胁迫下，“粤选1号”能维持较高的光合放氧速率，耐热突变体PSII的光合放氧中心没有受到高温胁迫的破坏，保证对H2O正常的光解，这与前人在对高温胁迫耐性不同的高粱品种上研究结果一致［13］．有报道指出，苜蓿在高温胁迫下，其叶片的ATP含量和ATPase活性显著下降，与叶绿体ATP供应不足有关［14］;推测在高温胁迫下只有保证H2O正常光解，才能维持叶绿体光合电子传递链正常的电子供应，以保证叶绿体类囊体膜内外侧正常的质子电势梯度，以利于进行ATPase光合磷酸化，保证叶绿体内多种代谢所需要的ATP供给．PSII受高温胁迫损伤后，psdD蛋白快速合成需要大量的ATP供应［15］．当ATP供应不足时，叶绿体基质中的RuBP-case无法表现出正常的活性，使CO2固定无法正常进行［16］．因此在高温胁迫下，PSII是否稳定直接影响到ATPase的活性及ATP的合成．

［1］LIU X，HUANG B．Photosynthetic acclimation to high temperatures associated with heat tolerance in creeping bentgrass［J］．JPlant Physiol，2008，165:1947-1953．

［2］TEZARA W，MITCHELL V J，DRISCOLL S D，et al．Water stress inhibits plant photosynthesis by decreasing coupling factor and ATP［J］．Nature，1999，28:914-917．

［3］LAWLOR D W，CORNIC G．Photosynthetic carbon assimilation and associated metabolism in relation to water deficits in higher plants［J］．Plant，Cell and Environ，2002，25:275-294．

［4］ZHENG C，JIANG D，LIU F，et al．Effects of salt and water logging stresses and their combination on leaf photosynthesis，chloroplast ATP synthesis，and antioxidant capacity in wheat［J］．Plant Sci，2009，176:575-582．

［5］HUANG W，ZHANG S B，CAO K F．Cyclic electron flow plays an important role in photoprotection of tropical trees illuminated at temporal chilling temperature［J］．Plant Cell Physiol，2011，52:297-305．

［6］陈平，席嘉宾，郭伟经．高温胁迫下粤选1号匍匐剪股颖新品系的生理效应研究［J］．草业学报，2004，13(2):79-83．

［7］陈平，郭伟经，席嘉宾．粤选1号匍匐剪股颖新品系选育［J］．草业学报，2005，14(4):42-46．

［8］覃广泉，陈平，周厚高．粤选1号匍匐剪股颖新品系果岭草坪夏季性状及高温胁迫效应［J］．中国农学通报，2005，21(2):20-22．

［9］李卫芳，王忠，韩鹰，等．小麦Rubisco活化酶的纯化及其活性特性［J］．中国农业科学，2002，35(8):929-933．

［10］莫亿伟，王忠，梁国斌，等．施氮处理对水稻子代乳苗素质的影响［J］．作物学报，2004，30(3):227-231．

［11］芮琪，张列峰，徐朗莱．小麦叶片内1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基由53 000到50 000裂解反应的定位研究［J］．南京农业大学学报，2006，29(4):23-27．

［12］YOICHIN，TUYOSIR，SUMIHOKO S，et al．Changes in ATP-related compounds of beef and rabbitmuscles and a new index of freshness ofmuscle［J］．Agr Bio Chem，1986，50(7):1751-1756．

［13］ALLAKHVERDIEV S I，NISHIYAMA Y，TAKAHASHI S，et al．Systematic analysis of the relation of electron transport and ATP synthesis to the photodamage and repair of photosystem II in synechocystis［J］．Plant Physiol，2005，137:263-273．

［14］莫亿伟，郭振飞．温度胁迫对苜蓿和柱花草光合作用及N同化的影响［J］．草地学报，2008，16(1):100-102．

［15］JAGTAPV，BHARGAVA S，STREB P，etal．Comparative effect of water，heat and light stresses on photosynthetic reactions in Sorghum bicolor(L．)Moench［J］．J Exp Bot，1998，49:1715-1721．

［16］陈根云，肖元珍，李立人．影响豌豆Rubisco组装的因子及其作用机制［J］．植物生理学报，2001，27(5):369-374．