贵州地方火龙果芽变种质DNA指纹图谱及遗传多样性的ISSR分析

张冰雪　范付华等

摘 要：【目的】为了构建火龙果芽变种质的DNA指纹图谱，并揭示种质间的遗传关系，【方法】以贵州近几年选育的一些优良火龙果种质为试材，采用ISSR标记技术和NTSYS 2.01软件对这些新种质及其原始品种进行分析。【结果】利用筛选出的52条引物进行PCR扩增，共扩增出364个清晰、重复性好的标记，其中215个（60%）为多态性标记。M08、845和881 等3个引物扩增出的标记能将22份种质区分开来。采用NTSYS 2.01软件计算，供试种质间的相似性系数为0.70～0.96，平均0.81，其中红肉种质间平均值为0.82，白肉为0.89。UPGMA聚类分析显示，在相似系数0.9处可将供试材料分为11类，其中7份分别各自聚类（红肉占86%）。【结论】火龙果体细胞变异率较高，且红肉品种高于白肉品种，通过芽变选种能有效地实现遗传改良。

关键词：火龙果； 贵州； ISSR； 遗传多样性； DNA指纹图谱

中图分类号：S667.9 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0573-05

火龙果（Hylocereus undatus）为仙人掌科量天尺属（Hylocereus）的果用栽培植物，原产于巴西、墨西哥等中美洲热带沙漠地区[1]，目前在我国台湾及华南地区有一定规模的种植[2]。贵州属南亚热带和中亚热带气候，早在2000年就开始引种栽培火龙果[3]，近年来通过芽变育种从红龙果（红肉）和白玉龙（白肉）两个品种中选出22个优良种质。分子标记已广泛应用于果树种质的遗传多样性分析。ISSR（inter-simple sequence repeat）是一种新型的DNA标记，它结合了RAPD和SSR的优点，已成为果树种质遗传关系研究的主要方法[4-5]。迄今，涉及火龙果分子标记的报道较少[6]，本文拟利用ISSR标记构建贵州近年选育的火龙果芽变新种质的DNA指纹图谱，并分析其遗传关系，为贵州火龙果种质的保护和遗传改良提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 DNA的提取及检测

1.3 PCR扩增及检测

1.4 数据处理及分析

每个引物的扩增反应设3次重复。检测结果显示，绝大部分带型可重复，极少数不能重复的谱带统计时忽略不计。统计谱带时按“引物编号-片段长度”进行记录，建立数据库，并分别用NTSYS 2.01软件与UPGMA法进行其相似性系数的计算和遗传关系树状图的构建。

2 结果与分析

2.1 ISSR标记的多态性分析

2.2 DNA指纹图谱

2.3 遗传关系和聚类分析

3 讨 论

3.1 火龙果品种鉴定和指纹图谱的构建

火龙果没有叶片，植株形态标记很少，与其他果树相比单从形态上更不易区分。分子标记能客观地反映其不同种质之间的基因组差异，不受取样部位和时间等因素的影响，是一种简单有效的方法。Wolfe 等[6]研究证明，ISSR分子标记能灵敏地揭示遗传关系十分相近个体间的差异。此外，Moreno等[7]研究证明，由于ISSR引物序列较长（16～25 bp），PCR扩增的退火温度较高，其扩增结果的重演性较高。Junqueira等[8]利用RAPD标记对16份火龙果种质进行遗传多样性分析，结果表明来自相同品种的不同种质其遗传差异性也较大，并认为分子标记技术在遗传育种中至关重要。相对于其他分子标记，ISSR具有成本较低、操作简便、重复性强等优势[9]。迄今，利用分子标记鉴别火龙果品种和构建指纹图谱的报道相对较少。本文利用52条ISSR引物对22个贵州火龙果种质进行遗传关系分析，共扩增出364条谱带，215条具有多态性，多态性比率（60%）高于Junqueira等[8]应用RAPD标记分析火龙果资源的研究结果。

22份种质的DNA指纹图谱显示，3份抗逆性种质的DNA在890-625处共同缺失。20号在引物825、827、841、848和862中的共获得5个特征性标记；21号在M03、813和835等9条引物中共获得17个特征标记，22号在865-1000处获得特征性标记，且这23个特征标记除825-375外，均为阴性标记。这说明ISSR可用于火龙果种质鉴别和指纹图谱构建。同时，这也表明火龙果抗逆性种质的突变类型可能是缺失型突变，但这些缺失片段是否真与其抗逆性有关，还有待进一步研究。

3.2 火龙果种质间的遗传关系

本文通过ISSR技术对22份火龙果材料进行遗传关系分析，结果表明，相同肉色的火龙果资源基本聚为一类。这与Grimaldo-Juárez等[10]的对红、白、黄和紫红四种不同肉色的21份火龙果资源的形态特征和生理生化指标的研究结果一致，其聚类分析结果显示，在遗传距离约1处它们基本按肉色分为4组。由此可见，决定火龙果肉色的遗传基础差异较大。值得注意的是，这一结果与我们对火龙果花器官结构差异较大的观察结果相吻合。前期研究发现，白肉火龙果资源的花筒处有明显弯曲，其雄蕊与柱头可接触，而红肉火龙果的花筒弯曲程度较小，其雄蕊明显低于柱头；此外，两者在花的外形上差异也较大，白肉火龙果的花较瘦弱；而红肉火龙果的花较饱满。因此，利用ISSR标记进行火龙果遗传关系的分析是高效而可行的。至于ISSR标记和植物学及农艺性状间的遗传关系尚待进一步研究。

火龙果种质资源遗传关系评价能为其合理利用和种质创新提供有利的依据。本文收集的火龙果资源，主要包含白肉和红肉两种资源，但两种资源中又包含不同抗逆性种质。本研究采用52条ISSR引物，对贵州22份火龙果种质进行PCR扩增，表现出较丰富的多态牲。李俊丽等[11]认为从分子水平来看，遗传距离的变幅越大，说明其遗传分化越大；遗传多样性高低与遗传背景复杂程度及该物种存在的历史长短密切相关。2种肉色火龙果资源中的抗逆性种质均单独聚类，这似乎说明决定火龙果抗性强弱的DNA遗传差异较大，也在一定程度上印证了群体的遗传多样性越高，其抗逆性越高的观点[12-13]。

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