苹果EST—SSR引物的开发及部分品种亲缘关系分析

宋尚伟　张恒涛等

摘 要： 【目的】开发苹果 EST-SSR 引物，评价苹果种质资源的多样性与亲缘关系。【方法】利用 NCBI数据库中苹果 EST 的 SSR 位点开发了 35 对 EST-SSR 引物，建立了苹果 EST-SSR 体系，并利用筛选出的 16 对引物对苹果品种资源的亲缘关系进行研究。【结果】118 份基因组 DNA 共扩增出等位基因位点 138 个，位点数的变化从 3 到 13 不等，平均每对引物检测到 8.62 个位点，总的多态性比率为94.2%，各引物的多态性比例分布为 81.8%～100%，相似系数为 0.48～1.00。利用 UPGMA 法构建聚类树状图，在相似性系数 0.65 处可将 118 个供试材料分为5大组：其中第1组又可分为2个亚组，包含了绝大部分供试材料；第2、3、4和5组包含的品种数目分别为 12 个、11 个、3 个和 2 个；第5组与其他组亲缘关系较远，相似性系数仅为 0.48。【结论】筛选出的 16 对 EST-SSR 引物可用于评价苹果种质资源间的遗传多样性。

关键词： 苹果； EST-SSR 引物； 亲缘关系； 聚类分析； 相似性系数

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0509-07

苹果属（Malus Mill.）植物种类繁多，分布广泛，多具有较高的经济价值。之前，分类学家从形态学、细胞学、孢粉学、同工酶等方面对苹果的亲缘演化关系进行研究并取得一定进展[1-3]。但传统方法对于差异不明显的形态有时难以识别，一些特征易受生态环境的影响，SSR 标记多态性丰富、稳定性突出，在苹果及近缘种质鉴别与亲缘关系研究中也已得到应用[4-6]。但开发 SSR 标记过程繁琐，成本较高，是其应用的主要限制因素[7]。EST-SSR 标记具有开发效率高、成本低的特点，是 SSR 标记的重要来源[8]，因其来自基因编码区，更易获得基因表达的信息，目前已经应用在葡萄[9]、甘蔗[10]、小麦[11]、大麦[12]、大豆[13]、水稻[14]等物种的遗传多样性分析、遗传图谱构建和系统演化研究等领域。近年来，随着苹果属 EST 库数据资源不断丰富，开发 EST-SSR 标记已具备了基础，姚利华等[15]用开发出的12 对 EST-SSR 引物对 20 个苹果品种的多样性进行了检测，Gasic 等[16]对苹果EST-SSR 在其他蔷薇科植物上的应用进行了研究。我们拟利用数据库资源开发新的 EST-SSR 标记，对 118 份苹果种质进行亲缘关系分析，以丰富该类标记资源，并对育种中品种资源的评估、筛选与利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 EST-SSR 序列的查找 利用 SSR 鉴定软件与网站在线搜索工具，从 GDR（http：//www.bioinfo.WSU.edu/gdr/）中搜索苹果属含有 SSR 的 EST 序列，并进行可利用性筛选，筛选序列长度不小于100 bp且不大于 700 bp 以及单至六碱基重复单元的重复次数至少为 10，6，5，5，5 和 5 的标准[9]。

1.2.2 EST-SSR 引物对的设计 应用引物设计软件 Primer Premier 5.0 对符合条件的部分 EST-SSR 序列进行引物设计。设计 EST-SSR 引物的原则和参数为：避免二级结构；引物长度一般控制在 18～22 bp；GC 含量在 40%～60%；理论退火温度 （Tm） 在 55～60 ℃ ，且上下游引物Tm 值相差不超过 5 ℃；产物长度控制在 100～350 bp，以更加有效地扩增目标 SSR。引物委托上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 基因组 DNA 提取及检测 采用改良的 CTAB 法[17]提取苹果叶片总 DNA。获得的 DNA 经紫外分光光度计检测OD260/OD280 比值；用 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度。将合格的基因组 DNA原液稀释到 20 mg·L-1 于-20 ℃ 条件下保存备用。

1.2.4 SSR-PCR 扩增 PCR 扩增在 PTC-200PCR 仪上进行。通过优化确定了稳定的苹果 EST-SSR 反应体系，即在 25 μL 体系中，MgCl2 浓度为 2.0 mmol·L-1，dNTPs 浓度为 0.3 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶用量为 1.0 U，DNA 模板用量为 1.5 mg·L-1，引物浓度为0.4 μmol·L-1。扩增程序为： 94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性 45 s，52 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸1 min，进行30个循环；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。

1.2.5 扩增产物检测及数据统计分析 从供试材料随机选取部分品种基因组 DNA 样品，用不同引物在上述反应体系中将其扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后以条带的多态性和稳定性为标准进行筛选。以选出的引物对各供试材料进行扩增，参照 Bassam 等[18]的银染检测方法进行检测。

凝胶上相同迁移率的条带假定来自同一等位基因，每个反应独立进行2次，不统计不稳定的条带或弱带。每对 EST-SSR 引物检测 1 个位点，电泳图谱的每条多态性带均为一个分子标记，代表引物结合位点的一个等位基因。根据条带的有无统计所有二元数据，有带计为“1”，无带计为“0”。所有引物对供试样品的读带记录结果形成 1-0 矩阵，相似性系数利用NTSYS-pc2.10e 软件中的 Qualitative date 程序来计算，获得相似系数矩阵；聚类分析用SHAN 程序和 UPGMA 方法进行，聚类图通过 Tree plot 模块生成。

2 结果与分析

2.1 EST-SSR 序列搜索结果

2.2 多态性 EST-SSR 引物的筛选

2.3 EST-SSR 扩增产物的多态性分析

2.4 相似性系数与聚类分析

在相似性系数为 0.65 处可将供试材料分为5个组，其中第1个组又可分为2个亚组，包含了绝大部分供试材料；第2个组有 12个品种（‘辽伏、‘首红、‘禹冠、‘4354、‘华帅、‘早翠绿、‘哈蒂、‘5号红星、‘美 2991、‘青香蕉、‘F4-4、‘礼泉短富）；第3个组有 11 个品种（‘理想、‘长富 2、‘哈丽、‘华红、‘80NY、‘布瑞本、‘红肉苹果、‘1996-1-21、‘葵花、‘红奥和‘国光）；第4个组仅有 3 个品种（‘皇家富士、‘红王将和‘早富）；第5个组仅有 2 个品种（‘孟诺耶和‘艾达红），相似性系数为 0.48，与其他品种亲缘关系较远。

3 讨 论

与其他分子标记相比，EST-SSR 标记来自表达基因的全部或部分序列，其多态性可能直接与该基因功能相联系。 研究发现，水稻的蜡质基因 5 端非编码区中的 SSR 序列（CT）n 长度变化不仅与直链淀粉的含量有关[18]。而且还决定了糯稻淀粉的理化特性[19]。因此根据 EST 包含的 SSR 位点开发的分子标记，是直接与功能相关的功能标记[20]。EST-SSR 标记的这一特点决定了其在功能基因标记方面应用前景广阔。

本试验通过对苹果 EST-SSR 引物的开发，筛选出 16 对多态性好，对苹果品种的区分能力强的引物。运用 NTSYS-pc2.0e 软件计算遗传相似系数，118 份苹果品种的相似系数为 0.48～1.00，说明供试的 118 份苹果种质资源间有较大的遗传变异，遗传多样性较高。并根据 16 对 EST-SSR 引物的扩增结果，对 118 个苹果品种进行了聚类分析，可以看出 ，同一个亲本苹果基本上都聚在一起，尽管所检测的 SSR 位点较少，但结果表明，绝大部分系谱相同或相近的品种聚在一起，个别品种分布在其他组中，与 Hokanson 等[21]的研究结果相近。说明用 EST-SSR 标记对苹果种质资源进行分类是可行的。

根据本试验聚类分析的结果，第2个组有 12 个品种（‘辽伏、‘首红、‘禹冠、‘4354、‘华帅、‘早翠绿、‘哈蒂、‘5 号红星、‘美2991、‘青香蕉、‘F4-4、‘礼泉短富）；在这些品种中，‘首红、‘哈蒂、‘5 号红星均为元帅系的芽变，因此在生物学特性上有很多相似之处。而‘华帅的杂交亲本为‘富士和‘新红星，‘华帅的果实外观与‘元帅几乎没有差别。‘早翠绿与它们相比，同样具有树势强健、树冠紧凑、适合密植，果实圆锥或圆形，以短果枝结果为主，腋花芽形成能力强等特点[22-26]。第3个组 11 个品种中，‘长富 2 为‘富士的芽变品种，而‘富士为‘国光与‘元帅杂交的后代。‘国光、‘富士、‘长富 2、‘哈丽、‘葵花、‘布瑞本、‘红奥这几个品种都有树势强、果面底色淡黄色或黄绿色，果点小，果肉黄白色，肉质细脆，汁多，酸甜适中等特点[22-25]。第4个组仅有 3 个品种，这3个品种均为富士系，‘皇家富士、‘早富为富士的不同芽变品种，其中‘红王将为从高接的‘早生富士上发现的着色系芽变，风味、采收期、树势与‘早生富士相近或相同[22]。上述结果表明，基于 EST-SSR 标记的聚类分析结果与品种间的系谱关系和表型是吻合的，因而应用该技术对苹果品种进行遗传关系研究，能够为种质的评估、利用和改良提供依据。

部分品种 EST-SSR 标记聚类分析结果与系谱资料不尽一致，如未将富士系芽变品种聚类在一组；第5个组仅有 2 个品种，均为‘红玉的杂种后代，亲缘关系相近，但2者与其他品种亲缘关系较远，相似性系数为 0.48。出现上述结果可能的原因之一，至少一部分 SSR位点与重要的育种性状连锁不紧密，所受的选择压力小，造成相同或相似系谱分离后代中不同等位基因在分配上的随机性；其二，即使选自同一组合的品种，由于选育过程中选择标准不同，仍可能造成较大的遗传差异，而这种差异无法反映在系谱资料中；第三，苹果基因组庞大而结构复杂，少量的 SSR 标记难以反映全部基因组所有区域上的遗传差异情况。

4 结 论

利用苹果 EST 数据库开发了 16 对多态性丰富的 EST-SSR 引物，并用其对 118 份苹果品种资源的亲缘关系进行研究，共扩增出结合位点 138 个，总的多态性比率为 94.2%，供试材料相似系数的变化在 0.48～1.0，在相似性系数 0.65 处可将 118 份材料分为5组。研究表明筛选出的 16 对 EST-SSR 引物可用于评价苹果种质资源间的遗传多样性。

参考文献 References：

[1] GAO Yuan， LIU Feng-zhi， CAO Yu-fen， WANG Kun. Analysis of genetic relationship for Malus germplasm resources by SSR markers [J]. Journal of Fruit Science，2007，24（2）： 129-134.

高源，刘凤之，曹玉芬，王昆. 苹果属种质资源亲缘关系的SSR分析[J]. 果树学报，2007，24（2）： 129-134.

[2] GIANFRANCESCHI L，SEGLIAS N，TARCHINI R， KOMJANC M， GESSLER C. Simple sequence repeats for the genetic analysis of Apple[J]. Theoretical and Applied Genetics，1998，96： 1069-1076.

[3] GALLI Z，HALASZ G，KISS E， HESZKY L， DOBRANSZKI J.Molecular identification of commercial Apple cultivars with microsatellite markers[J]. HortScience，2005，40： 1974-1977.

[4] ZHANG Q，LI J， ZHAO Y， KORBAN S S， HAN Y. Evaluation of genetic diversity in Chinese wild apple species along with apple cultivars using SSR markers[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2012， 30： 539-546.

[5] WANG Li-xin，ZHANG Xiao-jun，SHI Xing-yun，GAO Hua，ZHAO Zheng-yang. Establishment of SSR fingerprinting database on major apple（Malus×domestica）cultivars[J]. Journal of Fruit Science，2012， 29（6）： 971-977.

王立新，张小军，史星雲，高华，赵政阳. 苹果栽培品种SSR指纹图谱的构建[J]. 果树学报，2012，29（6）： 971-977.

[6] SUN Ping，ZONG Yu，LIU Jing，HU Chun-yun，TENG Yuan-wen. Study on genetic diversity of Malus sieboldii in Qingliangfeng Region based on SSR markers[J]. Journal of Fruit Science，2013，30（1）： 8-15.

孙萍，宗宇，刘晶，胡春云，滕元文. 基于SSR标记的清凉峰地区三叶海棠遗传多样性研究[J]. 果树学报，2013，30（1）： 8-15.

[7] RODER M S，KORZUN V，WENDEHAKE K， PLASCHKE J， TIXIER M H， LEROY P， GANAL M W. A microsatellite map of wheat [J]. Genetics，1998，149： 2007-2023.

[8] KOTA R，VARSHNEY R K，THIEL T， DEHMER KJ， GRANER A.Generation and comparison of EST-derived SSR and SNPs in barley （Hordeum Vulgare L.） [J]. Hereditas，2001，135： 145-151.

[9] SCOTT KD，EGGLER P，SEATON G，ROSSETTO M， ABLETT EM， LEE LS， HENRY RJ. Analysis of SSR derived from grape EST[J].Theoretical and Applied Genetics，2000，100： 723-726.

[10] CORDEIRO G M，CASU R，MCINTYRE C L， MANNERS J M， HENRY R J. Microsatellite markers from sugarcane （Saccharum spp） ESTs cross-transferable to Erianthus and Sorghum[J]. Plant Sci，2001， 160： 1115-1123.

[11] EUJAYL I，SORRELLS M E，BAUM M， WOLTERS P， POWELL W.Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，2002， 104 （2-3）： 399-407.

[12] THIEL T， MICHALEK W， VARSHNEY RK， GRANER A. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley （Hordeum vulgare L.）[J].Theoretical and Applied Genetics，2003，106： 411-412.

[13] SONG Q J， MAREK L F， SHOEMAKER RC， LARK KG， CONCIBIDO VC， DELANNAY X. A new integrated genetic linkage map of the soybean[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，109： 122-128.

[14] KANTETY R V，LA ROTA M L，MATTHEWS D E，SORRELLS M E.Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley，maize，rice，sorghum and wheat[J]. Plant Molecular Biology，2002，48： 501-510.

[15] YAO Li-hua，CAI Dan-ying，ZHENG Xiao-yan，TENG Yuan-wen.Developing EST-SSR Markers from ESTs of Malus Mill.[C]// Progress of Horticulture Shanghai： Shanghai Jiao Tong University Press，2008： 160-162.

姚利华，蔡丹英，郑小艳，滕元文. 从苹果属EST数据库中开发EST-SSR标记[C]// 园艺学进展，上海： 上海交通大学出版社，2008： 160-162.

[16] GASIC K， HAN Y P，KERTBUNDIT S，SHULAEVV，IEZZONI A F，Ed STOVER W，BELL R L，WISNIEWSKI M E， KORBAN S S. Characteristics and transferability of new apple EST-derived SSRs to other Rosaceae species[J]. Molecular Breeding，2009，23（3）： 397 -411.

[17] CHEN Kun-song， LI Fang， XU Chang-jie， ZHANG Shang-long， FU Cheng-xin. An efficient macro-method of genomic DNA isolation from actinidia Chinensis leaves[J]. Hereditas，2004，26（4）： 529-531.

陈昆松，李方，徐昌杰，张上隆，傅承新. 改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取[J]. 遗传，2004，26 （4）： 529-531.

[18] BASSAM B J，CAETANO-ANOLLE G，GRESSHOFF P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J]. Anal Biochem，1991，196： 80-83.

[19] AYERS N M，MCCLUNG A M，LARKIN P D. Microsatellites and a single nucleotide polymorphism diferentiate apparent amylose classes in an extended pedigree of US rice germplasm[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，94： 773-781.

[20] BAO J S，CORKE H，SUN M. Mierosatellites in starch synthesizing genes in relation to starch Physiochemical Properties in waxy rice（Oryza statiiva L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2002，105（6-7）： 898-905.

[21] HOKANSON S C， LAMBCY， W F， SZEWC-MCFADDEN A K. Microsatellite （SSR） variation in a collection of Malus（apple）species and hybrids[J]. Euphytica，2001，118： 281-294.

[22] THIEL T，MICHALEK W，VARSHNEY R K. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley（Hordeum vulgare L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106： 411-422.

[23] CUI Huai-yu， GAO Mei-xiu， HE Shui-tao. Dwarf dense planting cultivation in apple varieties[M]. Zhengzhou： Henan Science and Technology Press，1995： 21-24.

崔怀玉，高梅秀，何水涛. 苹果优良品种矮化密植栽培[M]. 郑州： 河南科学技术出版社，1995： 21-24.

[24] WANG Jing-yan， JIA Ding-xian， MI Wen-guang. New cultivar and cultivation key points of apple[M]. Shaanxi： Shaanxi Science and Technology Press， 1992： 65-67.

汪景彦，贾定贤，米文广. 苹果新品种及其栽培要点[M]. 陕西： 陕西科学技术出版社，1992： 65-67.

[25] GUO Zhao-nian. Dwarf dense planting cultivation in apple varieties[M]. Beijing： Jindun Press，2006： 25.

郭兆年. 苹果新品种及矮化密植技术[M]. 北京： 金盾出版社，2006： 25.

[26] SHU Huai-rui. Pomology[M]. Beijing： Agricultural Press of China，1999： 119-121.

束怀瑞.苹果学[M]. 北京： 中国农业出版社，1999： 119-121.