苹果实生砧木资源重要性状的遗传多样性分析

邢丽敏　槐心体　张新忠　王忆　韩振海

摘 要： 【目的】为了解苹果实生砧木资源重要砧木性状的种间、居群间和株系间差异及株系内性状分离，【方法】搜集了7个种21份苹果资源的种子，建立实生群体，播种当年调查实生苗株高、干粗、叶形指数和分枝数等形态性状，当年秋芽接富士和金冠品种，第2年调查实生苗越冬抽条率、耐盐性、嫁接芽萌芽率、抽梢率和成苗率。通过接种鉴定评价腐烂病和轮纹病的抗病性。【结果】形态性状种间差异显著，平邑甜茶形态一致性好。1 a生实生苗耐越冬抽条能力种间差异大。栽培品种实生苗耐抽条能力差，且易感苹果轮纹病。八棱海棠和平顶海棠耐盐碱性较强，山定子耐盐碱性差，且居群间差异极显著。腐烂病和轮纹病的抗病性均存在种间、居群间或株系间差异及严重的株系内性状分离。平邑甜茶和小金海棠的嫁接芽抽梢率和秋季成苗率均低。【结论】多数性状不仅种间、居群间或株系间差异显著，株系内性状也严重分离。选育、应用苹果无性系砧木是迫切需求。

关键词： 苹果； 实生砧木； 种质资源； 遗传多样性

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0516-10

中国拥有丰富的苹果属（Malus Mill.）种质资源，是世界上苹果属植物最大的基因中心，有17种苹果属植物起源于中国并仍有分布[1]。在这些种质资源中蕴藏着丰富的具有利用及潜在利用价值的资源，其中湖北海棠[M. hupehensis （Pamp.）Rehd.]、山定子[M. baccata （L.） Borkh.]、西府海棠（M. micromalus Makino）、楸子[M. prunifolia （Willd.）Borkh.]、新疆野苹果[M. sieversii （Led.） Roem.]等这些种常用作苹果实生砧木。研究实生砧木的种间差异和种内遗传多样性对合理利用砧木种质资源、实现苹果实生砧木区域化有重要意义。

因为苹果属植物大多数种间不存在生殖隔离，不同的种间容易杂交，再加上种的多倍化和无融合生殖现象，使得苹果属植物不仅种间差异显著，而且种内遗传多样性十分丰富。用8对SSR引物对苹果属的23个种、种间杂种和品种进行遗传多样性分析发现种质资源间存在丰富的遗传变异，等位基因的杂合度平均为0.623，多态性均值为0.828[2]。构建新疆野苹果分离群体时，新疆野苹果与栽培品种‘红富士杂交得到的110株后代，株系间没有重复现象[3]。不仅如此，苹果属植物种内也存在着丰富的多样性。用8对SRR引物对65份湖北海棠材料进行检测，其中6对得到的多态信息含量（PIC）超过0.80，而各个居群内的基因型却高度一致，表明居群内遗传多样性水平较低，因此湖北海棠种内变异主要来自居群间[4]。相反，用RAPD标记辅助分析新疆野苹果种内多样性，发现居群内遗传多样性占种内遗传多样性的83.1%[5]。对新疆野苹果进行SSR分析的结果表明居群间和居群内遗传多样性水平分别为15%和85%，均说明新疆野苹果种内遗传多样性主要来源于居群内[6-8]。

我国山定子、海棠果等苹果属资源分布区广泛，分布区之间气候和土壤条件差异大，通过长期的地理隔离、自然选择和人工选择，使得苹果种质资源产生了丰富的居群间遗传多样性。湖北海棠虽然无融合生殖能力强居群内表现一致，但是居群间变异幅度较大[4，9]。此外，用RAPD标记对东北、华北地区山定子8个天然居群分析，发现居群间基因分化系数（Gst）值为0.223 7，表明山定子居群间也存在着较高的遗传分化[10]。

长期的无性繁殖和自交不亲和导致苹果属植物实生居群内的株系间甚至同株系的植株间性状广泛分离。用分子标记技术，对山定子（I值变化为0.270 1～0.452 6） [10]、湖北海棠（I值变化为0.032 7～0.255 3）[9]、变叶海棠（多态性带百分率值为36.43～62.96）[11]等居群内，进行遗传多样性分析的结果，均说明了苹果属种质资源在居群内也存在着丰富的变异。

我们通过田间调查、接种鉴定等方法系统评价了苹果属7个种、21份苹果实生砧木资源在形态性状、抗病性、抗逆性等方面的种间差异及种内遗传多样性，对进一步认识实生砧木导致的变异以及实生砧木区域化利用提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 材料

于2011年3月温室营养钵播种育苗，5月上旬定植于中国农业大学八口果树实验基地苗圃。每份材料株数均在90株以上。畦宽1.2 m，双行定植，株距20 cm，常规水肥管理和病虫害防治。于2011年9月初芽接，每份材料分别嫁接富士、金冠各半。

试验中用于抗病分析的菌株，包括5种轮纹病菌株分别为MX1、LS1、ZZ26、LW023、LW048，其中LW023和LS1对苹果枝干的致病性最强，LW048和ZZ26致病性中等，MX1致病性最弱[12-13]。苹果腐烂病菌株分别为xc56和03-8均为强致病性菌株[14]。

1.2 方法

1.2.1 形态指标 形态指标的调查于2011年秋季新梢停止生长时进行，分别调查1 a生实生苗的株高、干径、分枝数量和叶片的长宽。每个实生群体中设3次重复，每次重复随机选取30株。用游标卡尺测定植株距地面10 cm处的干径，用卷尺测量株高，在植株中间部位随机选取5枚成熟叶片分别用游标卡尺测量它们的长度和宽度，以长/宽的比值表示叶形指数。

1.2.2 苹果腐烂病抗病性 休眠期对21份砧木资源进行苹果腐烂病抗病性枝条离体接种鉴定。菌株用刘欣颖等[15]报道的方法培养。采用改良后的菌饼接菌的方法对枝条进行接菌，每份资源以10根30 cm的枝段为1次重复，共设3次重复。枝条洗净并用70%的酒精对表面进行消毒，晾干后用Ф5 mm的打孔器在每段枝条上均匀打3个直至木质部的孔；用Ф5 mm的打孔器在菌落边缘打菌，将菌丝面贴向枝条上的小孔，再附上蘸有无菌水的脱脂棉保湿，用封口膜固定菌饼和脱脂棉；将接菌后的枝条放入培养箱中26 ℃恒温培养；7 d后调查接种孔发病情况，测量病斑长度。按刘欣颖等[15]报道的方法计算发病严重度。

1.2.3 苹果轮纹病抗病性 2012年春季从21份种质各取30株生长一致的实生苗，移栽到塑料口径30 cm营养钵中，置温室内。每株实生苗保留3根生长健壮的新梢用于抗轮纹病性活体接种鉴定。于2012年7月份接菌。苹果轮纹病病菌培养，枝干接菌和评价方法参照文献[12-13]的方法。

1.2.6 嫁接亲和性调查 嫁接亲和性调查内容包括：嫁接芽的萌发率（萌芽材料占总材料的比率）、萌发后抽梢率（萌芽并抽梢材料占萌芽材料的比率）以及嫁接苗成苗率（嫁接最终成苗材料占嫁接成活材料的比率）。21份种质均嫁接了金冠和富士2种接穗，所以每份种质对嫁接亲和性的调查都分两部分进行，将每份种质嫁接同种接穗的所用材料，按株数平均分为3组来统计。5月初调查萌芽率及抽梢率，9月中旬完成成苗率的调查。

1.3 数据处理

数据统计分析采用Excel 2007软件进行分析，用算术平均数来表征各数值性状的的平均水平，用标准差、变异系数等作为考查各性状群体内离散度的指标。显著性用最小显著差数法（LSD）进行多重比较，用相关系数来说明变量间的相关性。

2 结果与分析

2.1 形态指标测量结果及分析

除平邑甜茶之外，苹果实生砧木的许多性状在居群间、株系间、株系内均存在广泛分离，株系内的变异系数甚至与种间变异系数相当，苹果属实生砧木资源存在丰富的表型多样性。与砧木资源相比苹果品种实生苗的形态性状变异较小。

2.2 苹果腐烂病抗性

2.3 苹果轮纹病枝干抗病性

各种质资源枝干接种苹果轮纹病后发病的病情指数，种间变异系数为55.04%，山定子居群间为53.88%，其变异幅度接近种间水平；各株系间除平邑甜茶的株系间（CV=8.65%）变异较小外，变异系数均大于20%；株系内变异系数平均值为92.6%。综合表明，种间、居群间、居群内的株系间以及株系内均存在明显分离。

由图2可以看出，轮纹病的5种菌株与苹果属的各种质之间同样存在互作现象。其中楸子对ZZ26菌株有特异的抗性，而平邑甜茶材料7#E1N9对ZZ26菌株特异敏感，新疆野苹果对LS1和LW023敏感。

2.4 耐抽条

2.5 耐盐碱

试验田土壤pH为8.12，全盐量为0.35 g·kg-1，属于轻微盐碱化。种质资源黄化指数在重复间（F=0.18，F0.05=3.24 ）无显著差异，但种间（F=7.16，F0.01=3.41）差异极显著（图4）。山定子黄化指数高于其他砧木种，其中最严重的为辽宁居群的X-1-23和X-7-35，黄化指数分别为0.50和0.37。而八棱海棠（黄化指数为0.05）和平顶海棠（黄化指数为0.06）黄化指数低。山定子的不同居群间（F=10.01，F0.01=5.49）存在极显著差异；辽宁的山定子、平邑甜茶株系间（F=6.42，F0.05=5.14；F=10.86，F0.05=5.14）都存在显著差异，而山西的山定子株系间（F=0.55，F0.05=3.11）无显著差异。株系内的变异幅度不一致，平邑甜茶的株系12#N-1和7#E1N9、山定子株系S-1和S-2-1及楸子5个株系内变异系数小于20%。

黄化指数种间的变异系数为56.24%，山定子居群间为44.11%，变异水平都比较高；株系间变异系数均值为28.52%；株系内变异系数从5.41%到103.25%，八棱海棠（CV=103.25%）、平顶海棠（CV=70.06%）株系内变异系数高于居群间和种间变异系数。表明本试验耐盐碱性状的变异主要体现在种间和居群间差异，株系内耐盐碱性因物种而异。

2.6 嫁接亲和性

秋季芽接富士和金冠接穗后，翌年春季调查接穗萌芽率和抽梢率，秋季调查成苗率。结果表明，3个指标在重复间（F=1.29、1.33、0.30，F0.05=3.09）和接穗品种间（F=0.30、0.00、1.23，F0.05=3.94）差异均不显著。在砧木种间、居群间以及来源于辽宁的山定子株系间均存在显著差异（表5）。栽培品种实生苗和新疆野苹果萌芽率低。小金海棠和平邑甜茶抽梢率和成苗率均低于其他砧木，X-1-23和X-4-25的成苗率低，尤其嫁接金冠（图5）。

萌芽率（CV=39.00%）、抽梢率（CV=12.47%）在种间变异幅度较大；而嫁接苗成苗率在居群间（CV=23.26%）、辽宁山定子株系间（CV=37.08%）变异幅度大。各砧木资源的株系内萌芽率和抽梢率的变异系数均小于20%，有些砧木资源成苗率株系内变异幅度大，如X-1-23（CV=43.33%）、X-4-25（CV=33.44%） 及楸子（CV=27.41%）。

对萌芽率与抽条指数进行相关性分析，萌芽率与实生苗的抽条指数之间存在极显著负相关，相关系数r=-0.96（r0.05=0.43，r0.01=0.55）、决定系数r2=0.927 9。说明嫁接芽未萌芽主要与春季抽条有关。

3 讨 论

形态性状的差异是植物分类的重要依据，苹果实生砧木资源丰富，种间形态差异大。播种当年实生苗株高、干径及分枝数与苗木繁育直接相关[16]。本试验结果所有供试砧木播种当年均能达到离皮芽接的适宜高度和粗度，但新疆野苹果等实生砧木分枝数多，对嫁接工效有影响。调查的4个形态性状中，平邑甜茶表现出极高的形态一致性，与其无融合能力较高直接相关。山定子、怀来海棠也是我国重要实生砧木，怀来海棠包括八棱海棠和平顶海棠[17]。本研究山定子、八棱海棠、平顶海棠等砧木资源株系内形态性状分离严重。

有些重要砧木性状，如1 a生实生苗耐抽条能力，砧木资源间的变异主要来源于种间差异。对于同一植物学种，耐抽条性状在居群间、株系间差异以及株系内的分离程度不大。苹果良种繁育实践中选择实生砧木时选用适宜的植物学种即可[18]。生产上反对以苹果栽培品种实生苗作砧木繁育苗木[19]。本试验亦证明苹果栽培品种实生苗耐抽条能力差，且易感苹果轮纹病。

对于有些砧木性状，砧木资源的种间差异和居群间差异均较大。前人通过对苹果属各种内不同地理来源的居群的表型性状进行分析，认为花叶海棠、变叶海棠、新疆野苹果等居群内变异要高于居群间，而山定子居群的材料和湖北海棠的天然居群在居群间的变异显著高于居群内变异[20-24]。本文数据显示，相比其他砧木资源，八棱海棠和平顶海棠的黄化指数低，耐盐碱性较强，与文献报道一致[1]。相反，山定子黄化指数高，且居群间黄化指数差异极显著。另外，山定子居群间嫁接成苗率变异系数大。因此，生产上选择山定子作实生砧木时关注种子产地十分重要。

对枝干病害的抗病性也是砧木性状的重要指标。苹果种质资源对苹果腐烂病、苹果枝干轮纹病的抗病性存在显著的种间差异和丰富的种内遗传多样性[13，15，25-26]。本研究结果表明供试的实生砧木资源对苹果腐烂病和苹果轮纹病的抗病性不仅存在显著的种间差异，均存在显著的居群间或株系间差异以及严重的株系内性状分离。即使在形态性状一致性较好的平邑甜茶资源中，对苹果腐烂病的抗病性也存在显著的株系间差异和株系内性状分离。苹果良种繁育实践中选择实生砧木，既要选择抗病性较强的种，也应关注种子产地，还要对采种母树进行选择。即使如此，株系内的性状分离仍无法消除。本研究还发现，不同砧木资源对腐烂病或轮纹病的不同菌株的敏感性存在差异，与之前的研究结果完全相符[12-13，15]。

一般认为，无融合生殖率高的物种或类型的实生后代性状一致性好。平邑甜茶和小金海棠的无融合生殖坐果率分别为95.4%和86.7%[27-28]。本研究证明平邑甜茶形态一致性好，但小金海棠形态性状变异系数与其他砧木相似。因为小金海棠虽然无融合坐果率高，其实生群体中无融合生殖后代占51.27%，而无融合生殖后代染色体倍性也出现分离[29]。本研究发现，平邑甜茶的3个株系和小金海棠的实生苗秋季芽接，翌春接芽抽梢率和秋季成苗率均显著低于其他砧木资源，可能与接穗/砧木间的染色体倍性差异有关。平邑甜茶是湖北海棠中的一个三倍体类型，本研究中的小金海棠是四倍体[30]。

综上，苹果实生砧木资源重要性状不仅存在极显著的种间差异，相同物种的不同生态居群间或株系间亦存在极显著差异，而且多数性状株系内性状分离十分严重。选育、应用苹果无性系砧木是我国苹果产业发展的迫切需求。

致谢：中国农业大学植病系国立耘教授惠赠轮纹病菌株，西北农林科技大学黄丽丽教授提供腐烂病菌株03-8，中国农业科学院果树研究所周宗山研究员提供腐烂病菌株xc56。西北农林科技大学赵政阳教授、黑龙江省农业科学院牡丹江分院果树研究所刘延杰研究员、辽宁省果树科学研究所伊凯研究员、山西省农业科学院果树研究所杨廷桢研究员、山东省青岛市农业科学研究院沙广利研究员、张家口市林业科学研究所杨海廷高级工程师、西南大学园艺学院周志钦教授协助采集实生砧木种子，谨致谢忱。

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