微生物发酵法生产D-木糖酸

（青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266042）

糖酸类目前越来越受到人们的关注。它可以用于生产共聚酰胺类化合物[1]也可以作为1,2,4-丁三醇[2]合成的前体物质。很多关于D-木糖酸的应用已经被申请专利。微生物生产D-木糖酸的观点在19世纪末就已经被提出。多种假单胞菌属，醋杆菌属，气杆菌属，葡萄杆菌属，欧文氏菌属和相关菌种已经可以用来生产D-木糖酸[3]。细胞质中的D-木糖和D-葡萄糖脱氢酶类利用吡咯喹啉（PQQ）修复系统将电子传递给呼吸链上的细胞色素。这个过程会积累D-木糖酸和D-木糖酸内酯。D-木糖酸内酯是脱氢酶的直接产物，但是内酯会直接打开或者会在同种菌产生的内酯酶的参与下打开生成D-木糖酸。细胞质中的NAD+依赖型D-木糖脱氢酶将D-木糖氧化成D-木糖酸内酯[4]，再在内酯酶的作用下裂开生成D-木糖酸。D-木糖酸可能会脱水生成2-羰基-3-脱氧戊酸，并且进一步脱氢还原成α-酮戊二酸或者被醛缩酶裂解成丙酮酸盐和羟乙醛。虽然目前在真菌中只有一种编码D-木糖脱氢酶的基因得到了确认，但是已经有了关于酵母菌和其他一些真菌生产D-木糖酸的报道。

近来通过在各种酵母菌和大肠杆菌中导入D-木糖脱氢酶编码基因来生产D-木糖酸。几种D-木糖酸内酯酶基因序列近来已经得到确定，但是还没有对这几种酶进行深入研究。与细胞内D-木糖酸生产相关的线性传输机制或者菌体内的D-木糖酸的内酯形式目前还不明确。

除了本研究中所描述的微生物以外，D-木糖酸还可以通过酶法，电子化学方法或者化学氧化的方法生产[5]。在酸性亚硫酸盐处理的木料浆液中也发现了D-木糖酸。然而，从木浆液中得到D-木糖酸的有效的分离方法还没有建立起来。虽然D-木糖酸的很多应用已经被申请专利，其中包括从植物水解液中生产D-木糖酸粗品，但是工业化生产D-木糖酸仍然受到限制。笔者主要描述了利用细菌和真菌微生物生产D-木糖酸的现状。

1 细菌发酵生产D-木糖酸

1.1 木质纤维素水解液

木质纤维的植物废料可以为D-木糖酸的生产提供经济的原材料[7]。已经就利用半纤维素水解液将D-木糖转化成D-木糖酸的课题开展了若干次研究。研究发现氧化葡萄糖酸杆菌比恶臭假单胞菌更能耐受生物水解液中的毒素，但是其菌体生长和D-木糖酸的生产仍然受到高浓度木质纤维素水解液的抑制。可用二乙基酯提取液预处理或混合床树脂吸附或者离子排阻色谱法促使D-木糖在水解液中利用氧化葡糖糖酸杆菌转化成D-木糖酸。其中利用离子排阻色谱的方法可使D-木糖酸的产量提高最多。Turkia也发现用氧化葡萄糖酸杆菌发酵富含戊糖的麦秆儿水解液可以得到由D-木糖到D-木糖酸的低速率转化[8]。这个过程中D-木糖到D-木糖酸的转化不够完全，每消耗1 gD-木糖只能得到0.7 gD-木糖酸。超灰处理麦秆儿水解液可以除去一些芳香族脂肪族化合物。这种方法可以有效的使水解液达到完全转化。（即每消耗1 gD-木糖得到1.0 g的D-木糖酸）并且可以提高D-木糖酸的产率。仅1.0～1.5 g的菌体就可以得到1.1 g／L·h的木糖酸产率。这个速率只比用纯D-木糖为原料生产D-木糖酸低一点，与用离子排阻色谱法处理过的水解液相当。相比之下，灰处理来自ABNT的干酒糟固体酸性水解液比未处理的水解液D-木糖到D-木糖酸的转化率要低。

在稀释率D=0.03／h的流动培养时，氧化葡萄糖酸产生D-木糖酸的速率可持续3天维持在0.32 g／L·h。然而，水解液中只有50%的D-木糖被转化为D-木糖酸，并且菌体细胞会被破坏。（D-葡萄糖到D-葡萄糖酸的转化率大约为76%）

1.2 产量和转化率

虽然氧化葡萄糖酸杆菌D-木糖酸脱氢酶的最适PH是6，而D-木糖酸生产中所用pH为4.5甚至是 3.5。即使在菌体浓度很低（0.2 g／L·h）或者在无细胞生长的条件下在pH为4.5～6.5时，其生产率大概是 2 g／L·h[6]。在 pH5.6 条件下我们已经获得的D-木糖酸的产量高达12 g／（g菌体）·h。

由于氧化葡萄糖酸杆菌需要复杂的生长培养基，且会将大部分的糖用于菌体生长，所以其他的一些菌种生产D-木糖酸可能会更经济有效。例如葡糖醋杆菌被认为可以替代葡萄糖酸杆菌来生产D-木糖酸，因为其对营养物质的需求量小而且可耐受低 PH[9]。

基因工程菌生产D-木糖酸的第一例近来被述及。将来自新月柄杆菌的一个D-木糖脱氢酶编码基因导入大肠杆菌W3110,并且阻断D-木糖和D-木糖酸的代谢途径，通过这种方法，他们可以在一个分批培养过程中从40 g／L的 D-木糖生产出39 g／L的D-木糖酸。

虽然对于连续生产D-木糖酸还没有过相关报道，但是连续生产D-葡萄糖酸、2-羰基-L-古龙酸和2,5-二酮葡萄糖酸都已经被述及。Hardy描述了用D-葡萄糖或者乳酸盐做底物在稀释率D=0.2／h，pH6.8条件下提高假单胞菌的菌体产量时，D-木糖酸作为副产物其产率可达4／mmol(g菌体)·h。当D=0.04／h,pH5.5条件下利用氧化葡萄糖酸杆菌以40 g／L D-木糖和 20 g／L的 D-葡萄糖为底物我们观察到产率为1.5 g／L·h的D-木糖酸的持续生产。同时还会有D-葡萄糖酸，醋酸盐产生和菌体生长。在pH4.5的条件下的持续生产仍然可以进行。分批补料培养连续生产D-木糖酸的情况还没有相关报道。

2 重组酵母细胞生产D-木糖酸

2.1 酿酒酵母和D-木糖脱氢酶的选择

从里氏木霉中获取NADP+依赖型木糖脱氢酶的目的基因，将其在酿酒酵母中表达，Toivari等描述了利用该重组酵母生产D-木糖酸的过程。该酿酒酵母基因工程菌可产生高达3.8 g／L的D-木糖酸。同时可产生4.8 g／L的副产物木糖醇，通过除去GRE3编码的醛糖还原酶可以明显降低该副产物产量[10]。虽然这证明了用酵母生产D-木糖酸具有可行性，但是相比于那些用细菌生产或者用酿酒酵母生产的其他酸类其滴度和速率都很低。

最初，试图通过基因工程的方法改变氧化还原代谢途径，以提高NADP+的循环，但是这种方法没有提高D-木糖酸的产量。xylB基因具有更高的活力，而且对于D-木糖具有更高的特异性。xylB相比于xydl对于D-木糖酸产量的提高可能反映了其细胞质中脱氢酶具有更高的活力。然而，也可以说明产生了过量的NADH，NADH可以在电子传递链中被氧化从而积累能量，而过量NADH比NADPH更有助于D-木糖酸的生产。另一个需NADP+的D-木糖脱氢酶从煮沸中得到的SUS2DD在酿酒酵母中成功表达，表现与里氏木霉中xydl基因相似的活力和生产作用。

工业酿酒酵母菌株B67002xylB的表达使得D-木糖酸的生产比实验室菌株具有更高的浓度（43 g／L）,速率达到 0.5 g／L·h,这个数据是葡萄糖酸杆菌和恶臭假单胞菌的25%～30%。

2.2 其他可生产D-木糖酸的酵母

将来自瑞士木霉的xydl酶在克鲁维酵母中表达来生产D-木糖酸，但是xydl酶是NADP+依赖型的，并且其活力很低。虽然活力水平与那些观察到的酿酒酵母中的酶相似，但是与表达同样基因的酿酒酵母相比克鲁维酵母能以更高的速率产生更多的D-木糖酸[12]。适当提高底物浓度可以提高产量，但是当提供更高的D-木糖浓度时，等量的酿酒酵母菌株不能提高D-木糖酸的产量。相比之下，除去酿酒酵母中的GRE3只会降低木糖醇的产生。利用克鲁维酵母生产D-木糖酸，供氧会影响D-木糖向D-木糖酸、木糖醇、或者菌体量的转化。供氧充足的条件下，D-木糖代谢也更高效，但是即使是低得溶氧浓度，D-木糖酸的滴度或产率不会降低。

克鲁维酵母对植物废料水解液的耐受能力不高，但是其生产D-木糖酸的能力很高，这证明了可以利用克鲁维酵母替代酿酒酵母用D-木糖来生产D-木糖酸。

3 发酵法生产D-木糖酸的前景

虽然，非基因工程菌生产D-木糖酸的效率很高，但是既没有相关的商业产品的描述，也没有建立起经济的大规模的分离过程。目前的一些方法，比如沉淀或者离子交换，只适用于比较纯的溶液的小规模分离，不能满足大规模生产D-木糖酸[13]。因为D-木糖酸没有市场，所以没有推动其大规模生产的动力。然而随着对于替换D-葡萄糖酸的需求越来越迫切，人们对于大规模生产和提纯D-木糖酸的关注将会越来越多。

氧化葡萄糖酸杆菌对营养的需求复杂，生物量增长慢，需要昂贵的接种过程。因此，即使D-木糖酸可以很快从植物废料水解液中获得，但是其生产仍然受到限制。若干关于提高氧化葡萄糖酸杆菌菌体生长量的专利已经发布了[14]，但是破坏周边或者细胞质葡萄糖脱氢酶类的策略希望可以降低D-木糖酸的生产速率。热杀索丝菌的接种技术相对成熟，但是需要多步操作才能从植物水解液中除去抑制物。葡糖醋杆菌可能是一种可行的替代菌，但是还没有在水解液中做过测试。另一个值得关心的问题是木质纤维素水解液中产生的其他酸性产物的量以及分离提纯所需的费用。

现在基因工程细菌和酵母菌的产生可替代非基因工程菌的大规模生产D-木糖酸并且可能有更进一步的发展。基因重组后的大肠杆菌有更快的生产速率，更加有效地接种技术，菌体对营养要求低得优点。基因重组后的酿酒酵母和克鲁维酵母也具有生长良好低营养要求的优点。酿酒酵母和几种其他的酵母还有对多种纤维素水解液抑制物耐受性好[15]，低PH耐受性好的特点。基因工程菌的发展为工业生产D-木糖酸的发展打开了新的道路。

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