糖组学在生命科学及体育科学的研究述评

闫清伟 游春花

(西藏民族学院，咸阳 712082;西安工业大学，西安 710025)

一、糖组学的研究背景

糖组(Glycome)指的是细胞中全部糖链及相关糖基复合物。而糖组学(Glycomics)是专门研究糖链表达、调控和生理学功能的一门科学，主要研究糖蛋白的空间结构，确定糖蛋白的编码基因，分析探明相关蛋白质糖基化的内部机制［1－2］。牛津大学教授Dwek于1988年首次提出糖生物学的概念并由此产生了糖生物学是糖组学的基础研究部分，近年来该学科在糖链的结构、生物合成、生理功能等方面取得了巨大进展。日本学者的研究在寻找糖链合成的酶基因并解析糖链的功能方面取得了显著成果，美国学者在糖组相关数据库建立方面取得了显著成果，2004年美国和日本两国糖生物学方面相关专家学者在美国夏威夷州共同举办了2004美国、日本糖组学公会，为糖组学技术的发展提供了国际性的交流平台［3－4］。如今世界各国都为糖组学方面的研究做出了积极的贡献，我国在该领域的研究启动较晚，但也取得了可喜的成果，如在寡聚糖链的合成、蛋白质糖基化及糖苷酶、糖基复合物和疾病等方面的研究都取得了一定的进展。

二、糖组学研究的相关技术

(一)研究策略及内容

糖虽然不是基因的直接产物，但糖与基因有着密切的联系。因为糖组学的主要研究对象聚糖主要是从糖蛋白上分离出来的，这就与蛋白质组学以及基因组学联系起来，而糖组学对人体糖基化和糖结合蛋白研究的系统化和高通量的特性也体现了这种联系［5－6］。糖组学的研究中更多的是对糖肽的研究而非单纯的聚糖，所以从糖蛋白中分离纯化糖肽是糖组学研究的首要任务。糖组学的研究策略包括:收集研究对象个体中的全部糖组;锁定糖肽，并将糖组中的各种糖肽组分与基因组数据库相联系，最大限度的利用基因组的已有成果;研究糖肽的特征性质。而糖组学研究主要解决以下四方面的问题:a基因信息，即糖蛋白的编码基因;b糖基化位点信息，即所有可能被糖基化的位点中实际被糖基化的位点所在;c结构信息，即聚糖结构;d功能信息，即糖基化的功能［7－8］。

(二)研究技术

目前用于糖组学方面研究的相关技术已有很多种，基于各种技术在糖组学研究方面的侧重点不同，我们可以人为地将其分为结构糖组学相关技术、功能糖组学相关技术、以及生物信息学相关技术［9］，对糖链的研究中，因为糖链本身没有发色基因，为能更有效地检测糖链需要对其进行标记，因而又出现了糖链的标记技术。

1.结构糖组学相关技术。A.糖捕捉技术已被广泛用于糖蛋白的系统分析，通过与蛋白质组数据库的结合使用，该方法能系统地鉴定可能的糖蛋白和糖基化位点，目前已成功用于 Caenorhabditis elegans的糖组研究［10］。其基本策略包括:凝集素亲和层析分离蛋白，蛋白酶的消化，凝集素亲和层析分离糖肽，高效液相质谱(HPLC)纯化糖肽，以及糖肽的鉴定。然而近年来的研究发现:该技术也存在着不足之处，如不能用于O－糖肽的糖基捕捉，因其不能准确识别O－糖肽的糖基化位点;另外应用凝集素收集糖肽时，糖肽的种类会受到限制。因此有人提出应用化学捕获技术可以收集更多的糖肽，而近年来的研究使学者们普遍认为:从生物学糖捕捉法在鉴定某些低表达蛋白质方面比化学捕捉法更有意义［9，11］。B.双消化并串联柱法，在糖组学研究中，水解糖蛋白时较为有效的方法是双消化并串联柱法。该法基本策略为:首先，用用序列特异性内切蛋白酶(如胰蛋白酶)对SDS－PAGE分离后的糖蛋白进行凝胶内水解，取少量的蛋白水解物进行质谱分析，根据肽图谱或部分序列信息进行蛋白质鉴定;其次，将剩余的蛋白水解液用非特异性蛋白酶(如蛋白酶K)处理，此步骤能将上述水解液中的大部分多肽裂解为小分子肽(少于5个氨基酸);第三，将上述水解物通过Poros R微柱，其中的非糖基化肽被吸附在柱上，而糖肽则不被吸附，用洗脱剂将非糖基化肽从柱上洗脱后进行质谱分析测序;第四，将上述未被吸附的糖肽再通过石墨粉微柱，洗去低分子量杂质后，用30%乙晴－0.2%甲酸将肽洗脱下来，通过质谱和双质谱可以鉴定糖肽结构［12，13］。C.其他方法还有如双相凝胶电泳结合荧光染色和质谱技术，该技术可用于糖蛋白的筛选和鉴定;毛细管电泳结合质谱技术，该技术可用于快速常规分析以及产品监控，在分子诊断方面有很好的应用前景;另外还有核磁共振技术，该技术能够找出蛋白质糖基化的确切位点，检测糖链的空间构象，但因其敏感性不高，所以该技术对样本数量要求较高［9，14－16］。

2.功能糖组学相关技术。具有代表性的新技术是糖芯片(glycan chip，carbohydrate microchip)，也叫糖微阵列，是继基因芯片、蛋白质芯片之后伴随糖组学的产生而兴起的一种研究糖组学的新兴技术。糖芯片技术之所以受到广大研究者的青睐是因为它具有以下几个优点:A.大容量。可在有限的芯片表面上展示大量的糖;B.高度敏感性。每种糖的点样远远少于试验所需要的量，但敏感性大大高于传统的分子和免疫试验;C.长期稳定性。点在芯片上的糖一般很稳定，无需特殊处理就能长期保存，这是由糖类故有的理化特性所决定的。糖芯片根据其用途的不同可将其分为功能糖组学芯片和药物糖组学芯片两类，而根据展示在芯片上糖的特征可将其分为单糖芯片、寡糖芯片、多糖芯片和复合糖芯片。糖芯片在功能糖组学研究方面所发挥的作用主要体现在以下几个方面:一是研究糖－蛋白质的相互作用;二是研究糖蛋。与其他蛋白的相互作用;三是研究糖结合分子;四是鉴定受体的糖结合位点;六是鉴定微生物和宿主细胞交叉反应性分子标记;七是鉴定肿瘤抑制剂。而糖芯片的制作办法目前常用的有:表面吸附法、在片合成法、共价结合法、双层交联法。

3.生物信息学相关技术。生物信息学和生物芯片技术是生命科学研究领域中出现的新技术。生物信息学与生物芯片密切相关，生物信息学促进了生物芯片的研究与应用，而生物芯片技术则丰富了生物信息学的研究内容。生物信息学核心是基因组信息学，包括基因组信息的获取、处理、存储、分配和解释。而糖组学研究的深入必定为生物信息学提供理论基础和技术支持，但目前由于两者都还处于研究的起步阶段，一些现成的基因技术和蛋白质技术并不能很好地应用于糖组学研究，同样糖组学的相关技术也并没在生物信息学方面发挥理想作用，相关技术的创建与推广如芯片技术、复杂系统分析技术、信息系统分析技术等，都有待于进一步的研究。值得一提的是目前生物信息技术中相关数据库和网络信息为糖组学的研究提供了有益的帮助。如利用CFG可以查找糖链亚结构、分子量和组成等许多参数;而CCSD收集的众多糖链结构数据为糖谱的构建和糖链结构查新提供了很好的保障［17］。

4.糖链的标记技术。目前用于糖链标记的技术主要有放射性同位素标记、探针标记、紫外及荧光物质衍生化技术等［18－20］。

三、糖链的功能

糖组学研究的功能性糖链主要有功能性低聚糖、功能性多糖、糖簇分子。有研究报道:功能性低聚糖具有调节和恢复肠道内微生态平衡、促进矿物质的吸收和维生素的合成等一系列保健功能;功能性多糖对疾病的发生、发展和预后有着重要作用，主要表现在它的免疫调节作用、诱导肿瘤细胞凋亡、降血压作用、抗病毒作用和抗辐射作用;而糖簇的作用则通过多分子糖链与凝集素结合产生的簇效应来实现，它能够提高糖链的生物活性，其作用主要表现在抗病毒、免疫治疗、器官移植方面，有些还具有肝靶向作用等［21－25］。糖链一般由相同或不同型的单糖聚合而成，携带有重要的生物信息，有着重要的生物学功能:如标记功能、细胞免疫功能、血型抗原、细胞恶化标记、水溶性、保护性、修饰等功能。其标记功能主要在糖链、糖蛋白的识别和被识别反应过程中起作用;免疫系统中起免疫作用的糖蛋白主要是靠其单糖基与受体的相互作用来激发其免疫功能;血型抗原指红细胞膜上不同类型的寡糖链的糖蛋白和糖脂分子，它们与血清中相应的抗体构成识别体系;细胞恶化时细胞膜上的相应糖蛋白会发生改变，如恶性肿瘤发生时，细胞膜上的P糖蛋白过度表达，通过对相关糖蛋白的监控，可以尽早发现细胞的恶化;糖链的水溶性功能主要是因为糖分子本身水溶性极高，它与蛋白质或脂肪等大分子结合后，可以大大提高这些物质的亲水性，从而改善其功能和理化性质，这为改进基因表达产物的功能和物理化学性质提供了新思路和新手段;糖链的保护作用主要体现在:糖链分子上的酸性糖基能够保护蛋白的稳定性;而糖链的修饰作用主要体现在:糖链能直接参与蛋白质的空间折叠过程，这对于糖蛋白的结构、功能有重要作用［4，26－28］。

四、糖组学在基础生物学领域的研究

糖链虽不是基因的直接产物，但与糖链合成的相关基因却种类庞杂、数目巨大。要破译如此庞大数量的基因，并探明其与糖链合成的具体信息，对于处于初级阶段的糖生物学来说，无疑是件难事，所以目前生物学界把目标锁定在其中少数直接作用于糖类的管家基因和具有突变致死性的糖类相关基因上，以及某些关键糖基转移酶、糖苷酶、凝集素和糖类转运蛋白基因及其产物上，作为化学糖生物学的主攻靶标，因为正是这些基因与人类的疾病与健康关系最为密切［29］。

管家基因(housekeeping genes)是维持细胞最基本的生存功能所必需的基因，因而也是在所有或大部分有核细胞内都能保持高水平表达的基因，亦即其表达与否与细胞分化状态无关。与此相对应的是奢侈基因(1uxury genes)或组织特异性基因，它们是参与多细胞生物细胞社会性相互作用的基因，其表达具有细胞类型特异性。由于糖链普遍分布于细胞表面和细胞外基质，糖链在细胞分化与细胞社会性相互作用过程中具有公认的重要作用，因此大量糖类相关基因均属于奢侈基因。然而糖链在细胞内部还能够确保蛋白质的正确折叠与定向分布，参与信号转导、调控染色质的结构和基因转录，这些功能对于维持细胞内大分子网络的稳态均有关键作用。这类作用与糖代谢一样，是细胞基本生存所必需的，因而都涉及管家基因的活动。

基因敲除技术的大规模应用使人们陆续发现了许多突变后具有致死性的糖类相关基因，这类基因突变常常涉及某种关键糖生物酶的活性降低，人们已经尝试用小分子化合物作为“分子补丁”，与缺陷的酶特异结合并纠正其结构缺陷，从而恢复酶的催化能力。人体内多种天然关键碳水化合物酶的活性有很大的储备或冗余性，即酶活性大大超过正常生理活动的需要，所以即使只能将缺陷酶的活性恢复到野生酶的10%－20%左右，也足以纠正底物或异常产物的累积，治愈疾病。但由于每一种酶、甚至同一种酶的不同基因缺陷所需要的“分子补丁”都大不相同，所以必须进行大量的筛选工作，并建立突变基因库和“分子补丁”库，才能扩大受益患者的范围。

细胞对糖链信息的编码主要是通过糖基转移酶(GT)催化的糖基化(glycosylation)反应实现的。糖基化是生物体内糖链或糖苷生成的关键反应，它是指在糖基转移酶的催化下，一个糖分子与另一个糖分子(或糖基)、或者一个糖分子与其他生物有机分子之间以生成糖苷键的方式共价结合的过程。糖基转移酶的催化反应方式有两大类型:一类为供体糖基的端基碳构型反转;另一类为供体糖基的端基碳构型保持不变。多数糖基转移酶以糖核苷酸为活化的糖基供体，但也有一些糖基转移酶能够利用除了糖核苷酸以外的其他活性糖苷前体如糖基磷酸脂作为糖基供体。糖苷酶(glycosNases)对糖链的修剪及其他碳水化合物酶对糖链的多种修饰活动也起着重要的辅助加工作用。人体中的供体活性糖苷主要有四种类型:UDP－糖核苷酸(其中的糖基包括 G1c、Gal、G1cNAc、GalNAc、GlcA、IdoA、Xyl);GDP－ 糖核苷酸(糖基包括Man和Fuc);CMP－糖核苷酸(只有CMP－Neu5Ac一种);糖基磷酸长萜醇脂(包括 Glc－P－Dol、Man－P－Dol、OS－P－Dol)。细胞对糖类信息的解读主要通过糖链参与的分子相互作用而实现。糖类与蛋白质之间的相互作用涉及到种类繁多的、能够特异地识别糖链的蛋白质，主要包括:酶类、抗糖抗体、转运蛋白、细胞因子、除抗体以外的免疫分子或免疫因子、凝集素等。其中凝集素(1ectin)是能与糖类特异结合，但不具备针对糖类的酶活性、亦并非针对糖类的跨膜转运蛋白、也不属于抗体的蛋白质。凝集素对糖类的特异性结合是靠其分子上的糖识别结构域(CRD)实现的。此外，糖类与糖类之间的糖－糖相互作用也直接参与细胞对糖链信息的解读，例如:细胞表面血型糖抗原Lex－Lex相互作用在早期胚胎细胞的相互识别中有重要意义。

五、糖组学在医学领域的研究

近年来的研究认为:从某种意义上讲，糖药物的副作用比其它药物小，它们靶向定位到机体的特定部位，不仅能进一步减少副作用，而且能降低使用剂量。临床医师运用一种测试追踪技术，认识到糖尿病的血红蛋白有异常糖基化现象，该现象与相关酶的活性有关。糖基化的蛋白质以外的血红蛋白被认为与糖尿病患者的组织损伤有关。这种异常糖基化也引发其他一些疾病，如某些先天性肌肉萎缩症、癌症、自身免疫性关节炎、类风湿关节炎等。很多种疾病是由带有异常糖链的糖蛋白和糖脂引起的。

从science杂志的一个主题为碳水化合物和糖生物学的报道中我们可知糖组在未来的医药领域有广阔前景［30］。例如，glyconutrients［糖质营养素，包括8种糖:葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、木糖(Xy)、N－ 乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N－乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N－乙酰神经氨酸－唾液酸(NANA)］对两种不同类型的先天性异常糖基化所引起的遗传性疾病都是有用的。这些疾病的发生一般与基因突变引起的相关酶合成有关，因为正是这些异常合成的酶引起了糖蛋白上糖链的异常。该先天性糖基化障碍引发了慢性胃肠道、血液、神经系统的问题，若在饮食营养中加入甘露糖则有明显疗效。岩藻糖补剂对于治疗另外一种先天性糖基化异常病－－白细胞自身免疫缺陷病有重要作用。另一个例子是应用糖生物学研制疫苗。如流感嗜血杆菌B或Hib疫苗，这是一个糖基疫苗。糖作为组成部分，有助于改善疫苗的抗原。另一个潜在的应用是研发癌症疫苗。通过改变肿瘤抗原的糖链结构，使免疫系统可以更好地识别、攻击并摧毁肿瘤。新糖基运载系统等化疗药物的商业发展使得5－氟脲嘧啶被提出并进行I期和Ⅱ期的研究。

糖组学研究在病毒性心肌炎的解构方面也有进展。改建引起病毒性心肌炎病毒的被覆糖结构(例如那些造成乙型肝炎和丙型肝炎的病毒)，可能在防止病毒复制方面是有用的。糖基化的一个主要的作用，体现在T－细胞抗原结构和功能的维持，主要组织相容性复合物与免疫球蛋白的糖链的合成、稳定、和识别。此外，ABO血型是基于在糖链组成上的不同而划分的。另一有关糖生物学的研究人员在麻省理工技术学院的研究也指出［31］:许多碳水化合物以糖链即聚糖形式存在，而不是单糖形式。这种糖链有的与蛋白结合并以聚糖蛋白的形式作为膜被覆于细胞表面，它们参与细胞的信号转导以及细胞与周围环境的物质、能量的交换。糖蛋白在结构上有很高的选择性，例如，肝素结合抗Ⅲ，抑制血液凝固。此外，这种信号对多种生化途径和疾病进程是至关重要的:如癌症，血管生成，组织修复，骨骼发育，心血管疾病，和微生物感染。糖胺聚糖，如与肝素密切相关的硫酸乙酰肝素也与蛋白质有着密切的联系。当结构异常时，它们可能会导致肠和膀胱保护屏障的丧失，从而引发炎症性疾病［32］。如上所述，糖组作为基础的药物疗法正在研究。

六、糖组学在体育科学领域的研究

糖组学作为一个新兴的研究就热点，其在体育科学中的研究尚未见报道，但依据功能糖组携带的强大的信息量，其在体育科学的应用前景会比较广泛，且随着学科间的进一步融合和新兴交叉学科的出现，糖组学将会逐步被广大体育科研工作者认识，进而在体育科研领域的应用取得突破。比如利用糖组相关技术探明运动相关的优秀糖组信息，进而建立糖组信息库，再结合基因组、蛋白质组相关信息可使运动员选材更加科学合理;利用糖组信息探明相关管家基因的功能，可推动相关基因兴奋剂检测技术的发展;探明相关糖蛋白在免疫反应、信号转导等的生物信息，有利于运动疲劳机制的研究，可用于运动员机能评定、延缓疲劳以及疲劳后的快速恢复;同时，糖组学的发展在运动性损伤以及运动性疾病的防治方面也会得到很好的应用，比如近年来有研究证实，糖质营养素在治疗重症肌无力方面有明显疗效。随着运动相关糖组信息的研究，也必将引起相关专门性的新兴学科的出现，比如运动功能糖组学。

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