高等植物花发育的分子生物学研究

廖志琴，程 华，李琳玲，程水源

(1.武汉工程大学 化工与制药学院，湖北 武汉430074;2.经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室/化学与生命科学学院，湖北 黄州438000)

高等植物的花发育，是其生长发育过程中的重要阶段，也一直是一个重要的研究方向。对于植物花发育的研究，起初仅局限于形态分化和生理生化两方面，对其分子生物学方面的研究不过开始于二十世纪九十年代。一般以AG、DEF 和FLO 基因分别从拟南芥和金鱼草中成功分离出来，作为花发育研究进入分子水平的标志。目前的研究不止在模式植物中取得巨大成功，也在果树，林木等大型植物上取得相当可观的进展，但不同物种之间研究进展差异很大。

1 花发育的特点

花芽分化是植物由营养生长向生殖生长转变的过程，是指植物茎生长点由分生出叶片，腋芽转变为分化出花序或花朵的过程。植物的花发育一般被分为开花诱导、花的发端和花器官发育3 个阶段，是由多基因调控的十分复杂的过程［1，2］。开花诱导是植物生殖生长的第一个阶段，这一阶段，植物的顶端分生组织由营养生长向生殖生长转变，是主要以成花基因的启动为主要特点的生理生化过程，这一过程主要受光周期促进、春化促进、自发促进、开花抑制和赤霉素诱导等多个途径的共同控制［3，4］。该阶段植物的茎顶端分生组织在形态上并没有发生变化。植物开花途径整合基因的表达激活花/花序分生组织特异基因，导致茎顶端分生组织向花序(花)分生组织转变，形成花序(花)分生组织，这一过程称为花的发端。由于花序/花分生组织特异基因的表达，激活了花器官特异基因，从而形成花器官，完成花器官的发育。

对于某些木本果树的花发育，有一个花芽孕育临界时期确定的问题。研究发现，木本果树花芽孕育与新梢停止生长有关，黄海、曹尚银［5］用标记同时停止生长的短枝研究证明苹果花芽孕育临界时期从着生这个芽的枝条停止生长开始，一直持续到花芽形态分化开始，这段花芽孕育所必须的时间称之为“花芽孕育的临界时期”。若完成花芽孕育的时间得不到满足，花芽就不能形成，而一旦形成花芽就不可逆转，且临界时期有品种，地区差异。

2 开花诱导的4 个遗传途径

植物在不同的生活环境中进入花发育的状态受不同途径的诱导，因物种种类不同而有差异，且同种植物也会有开花备选途径。前人认为高等植物的开花转换是一个此消彼长的过程，促进和抑制物质的分布及数量的调整影响着植物花发育的过程。对拟南芥的一系列研究成果表明，开花主要是一个体内抑制状态在环境因子和体内发育信号的诱导下逐渐解除的过程，解除方式可能要通过多种途径进行。促进植物开花的主要途径包括光周期途径、春化途径、自主途径和赤霉素途径，植物需要整合各途径的发育信号且在体内传递到达顶端生长点，才能开启花的发育过程。

2.1 光周期途径

光对植物花发育的影响主要有光照时间和光质(光的波谱组成)两方面。嫁接、去叶等光周期诱导研究试验发现，植物对光周期反应的部位是叶片，其产生成花刺激物经韧皮部运往茎尖，开启花原基的发育，光周期途径包括叶片对光信号的捕捉、昼夜节律的推动以及移动信号的产生和传导［6］。在拟南芥突变体的研究中已克隆了很多光周期依赖的基因，包括GI、FD、FHA、FT、TOC1、LHY、CCA1 和ELF3 等。TOC1、LHY、CCA1 是影响昼夜节律的基因［7］，GI 是调节昼夜节律钟和开花时间的一个关键因子［8］，它分别通过CO 途径和miR172 途径诱导FT 表达，两途径在长日照下共同促进开花［6］。CO 和FT 都在叶片中表达，FT蛋白可进入筛管，再运输到茎顶端分生组织，与bZIP 类转录因子FD 蛋白组成复合体，从而激活AP1 和SOC1，SOC1 直接结合LFY 启动子，促进LFY 表达［9］。由于FT 蛋白可以移动，且在不同物种中相似，已证明FT 蛋白就是成花素组分之一［10］，目前已在多种果树中克隆到其同源基因［11，12］。ELF3 负调控GI 蛋白量［13］。

2.2 春化途径

春化作用主要通过抑制FLC 的活性来促进开花，FLC 蛋白属于MADS －box 蛋白，可维持芽顶端的营养状态［9］。FRI 和SUF4 蛋白结合成复合体，连接到FLC 的启动子上促进FLC 的表达。低温可诱导VIN3 的表达，该基因与组蛋白去乙酰化有关，能抑制FLC 的转录，VRN2 复合体促成FLC 染色质的异染色质化［14］，减少FLC 的转录，而VRN1 参与对FLC 染色质区域的甲基化作用［15］。FLC 蛋白可结合到FD 的翻译起始位点上游、SOC1 的启动子上以及FT 的第一个内含子上，抑制这些基因的表达［16，17］，但对FT 的抑制作用是间接形成的。在拟南芥中，春化作用能够维持FLC 表达的抑制状态，直到花粉第二次有丝分裂的S 期才可能回到正常的表达状态［9］，因此，子代植株须重新进行春化处理。苹果、葡萄、枳等果树中已有春化作用途径相关基因的报道，在一种早实枳突变体中分离得到了FLC 基因PtFLC，它抑制开花，且表达分析显示，PtFLC 在冬天上调表达，在春、夏天则下调表达［18］。

2.3 自主途径

当缺乏环境因子(低温、光照)的诱导，植物在营养生长达到一定阶段后也会开花，至今还没有发现在拟南芥的众多突变体中有不开花的，这种植物内部控制开花的途径称为自主途径。这些开花基因包括FY、FLK、FCA、FPA、LD、FLD 和FVE，在长日照或短日照条件下总是促进开花，且它们彼此之间互不调控基因表达，也不产生级联放大效应，而是以平行的方式发挥作用。自主途径主要通过控制FLC 的表达来促进植物开花，并且通过不同的分子机制调控FLC 的表达［19］。

2.4 赤霉素途径

GA 在短日照条件下可诱导拟南芥LFY 和SOC1 的表达，从而促进开花。赤霉属可能通过启动子上类似于MYB 转录因子结合位点的序列调节LFY 基因的表达［20］，AtMYB33 是miR159 的一个目标基因，miR159 在短日照下负调控At-MYB33［21］，AtMYB33mRNA 被剪切，LFYmRNA 减少，开花延迟。GA 的合成场所是在新生组织中，这也是GA 调控反应的位点，GA 可从叶运输到茎顶端，诱导开花，GA 合成的关键酶为GA20ox，编码此酶的5 个基因(GA20ox1 ～5)的表达受活性GA 的负调控，也受到外界环境信号的调控。长日照处理可以诱导GA20ox 编码基因的表达，从而促进开花［22］。GA 调控的具体机理还有待人们进一步研究。

在开花诱导过程中，各途径的基因效应最终都整合到了几个关键基因:FT、LFY、SOC1 和FLC，这些基因实现对植物开花时间的调控，其中，LFY 也是花序分生组织特异基因。春化作用和光周期途径能整合环境信号和内源发育程序，分别在低温处理和长日照下促进开花，赤霉素(GA)在非诱导短日照下促进开花，自主途径在所有的条件下调控开花。

3 花/花序分生组织形成

植物开花途径整合基因的表达激活花/花序分生组织特异基因，如FUL、CAL、LFY 和AP1 等，从而形成花序(花)分生组织，这一过程称为花的发端。AP1 在花器官发育中还控制萼片和花瓣的发育。在拟南芥中，LFY 和AP1 的作用是使花序分生组织侧面形成的原基发育为花，而不是叶芽，两基因的单突变体表型为花向叶芽的部分转变［23］。AP1 的功能与LFY 部分冗余，其表达时期晚于LFY，两者具有加合效应，能相互促进表达［24］。CAL 与AP1 同源性很高，属于MADS 盒基因，表达模式也与AP1 相似［25］。

杨树作为木本模式树种，其LFY 同源基因在花芽发育过程中的表达模式为:以毛白杨为例，PtLFY 在毛白杨雌雄花芽中持续稳定表达，但该基因在雄花芽中的相对表达量明显高于雌花芽，解剖分析结果表明，雄花芽形态分化进程明显早于雌花芽，这种差异可能与PtLFY 在雌雄花芽发育过程的差异表达存在密切联系［26］。

提高植物的花/花序分生组织特异基因的表达量，也能够促进其提早开花，如安利忻［27］将拟南芥的AP1 基因克隆入植物中间载体p208，通过根癌土壤杆菌介导的方法转化矮牵牛，得到的两个株系的转基因矮牵牛在R0 代即表现出提前且持续不断地开花的特性，与对照差异显著。吕晋慧等［28］将AP1 基因转入“玉人面”地被菊，使之提早开花。垂枝桦中FUL 的同源基因BpMADS4和BpMADS5 在烟草中过量表达时会使转基因植株开花大大提前，其中BpMADS4 与FUL 的同源性最高，且在花、芽和根中均表达;BpMADS5 则在花和未成熟果实中特异表达，Flachowsky［29］等将垂枝桦的BpMADS4 基因在苹果中超量表达，结果使苹果开花提前。

4 花器官发育

植物花器官的发育由花器官特异基因控制，在某一细胞中特定的基因组合可决定其发育形态。种子植物的成年花器官由花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊(心皮)等四轮结构组成，花器官排列成向心的圆环形，称作轮性。野生型金鱼草和拟南芥的花由四个花萼组成最外侧的第一轮，依次向内为四个花瓣组成第二轮，六个雄蕊组成第三轮，两个融合的心皮组成第四轮。基于对拟南芥和金鱼草的各类花器官同源异型突变体的研究，研究者发现了一系列调控花器官形成的器官特征基因，1991 年Coen 在此基础上提出花器官特征决定的“ABC”模型，该模型认为被子植物的四轮花器官由具有不同功能活性的A、B、C 三类基因决定，A类基因单独作用决定萼片的特征，A 和B 类的共同作用决定花瓣的形成，B 和C 类共同作用决定雄蕊的产生，C 类基因单独作用决定心皮的特征。此外，A 基因和C 基因相互拮抗。

从拟南芥中克隆得到的基因中，AP1 和AP2属于A 类基因，在花器官的第一和第二轮中表达，AP3，PI 为B 类基因，在第二和第三轮花器官中表达，AG 属于C 类基因，在第三、四轮花器官中表达［30］。

在蓝桉中已经克隆到AP1 的同源基因EAP1和EAP2，它们主要在花芽内表达。此外，在未成熟的盖瓣和花托内也有表达。利用转基因技术将EAP1 和EAP2 转接到拟南芥中，发现其过量表达与AP1 的过量表达结果相似，且转基因植株提前开花［31］。

小黑杨中分离得到的AP1 同源基因XxAP1，在花器官原基形成和花器官分化时期持续稳定表达，在花器官生长时期表达量有下调趋势［32］。

Nilsson 等［33］从挪威云杉中分离出3 个与拟南芥AP2 同源的基因，包括PaAP2L1、PaAP2L2和PaAP2L3。这3 个基因的表达模式各有不同。在拟南芥中过量表达PaAP2L2 会阻碍植株的生长，在第3、4 轮花器官中雌雄蕊的数目有所增加，且开花有所推迟。在拟南芥ap1 突变体中过量表达PaAP2L2，可促进花瓣特征的决定，说明它们有与AP2 基因功能相似的作用。

张彦峰等［34］在芸苔属雄蕊心皮化雄性不育系分子机理研究中发现有2 类AP3 基因(BAP3和BAP3 －24)共同调控芸苔属植物花瓣和雄蕊的发育。BAP3 和BAP3 －24 基因高度同源，但两者的功能却显著不同，BAP3 具有形成花瓣、雄蕊的双重功能，而BAP3 －24 仅具有形成雄蕊的功能和促进萼片化花瓣发育的剂量效应。

侯计华［35］在果梅中克隆到AG 基因，发现AG 基因主要在果梅的萼片、雄蕊、雌蕊、果皮和种子能检测到，且表达量较高，但是在叶片以及花器官的花瓣中不表达，比较转AG 基因烟草与对照的植株大小，发现转基因的烟草植株与对照相比，雄蕊中的花药低于雌蕊或与雌蕊齐平，而且花瓣颜色变成了浅粉色。

在矮牵牛中，FBP7(floral binding protein7)和FBP11 (floral binding protein11)从胚珠原基起始到胚珠成熟的过程中都有表达，当转基因共抑制FBP7 和FBP11 基因后，导致胚珠被同源异型化，转变为心皮化的结构［36］。这说明 FBP7 和FBP11 是控制胚珠发育的基因。经研究表明胚珠的发生是独立于心皮的。拟南芥中也有一些基因与C 类基因同源性较高，但功能有所不同［37］，如SHP1 和SHP2，在心皮和果实中特异表达，在胚珠中特异表达的还有AGL11 和AGL13 基因，它们一起被归为D 类基因，D 类基因控制胚珠的发育。

在拟南芥中还有一类基因，SEPALLATA1、SEPALLATA12、SEPALLATA13，它们的基因序列高度相似，并且功能密切相关［38］，SEP1 和SEP2基因在四轮花器官中均有表达，且在各花器官原基中起始表达早于AG、AP3 和PI。而SEP3 仅在花瓣、雄蕊和雌蕊中表达。B 和C 类功能基因的活性需要SEP 的参与，继而将SEP1/2/3 基因命名为E 类基因，E 功能基因参与控制花瓣、雄蕊、心皮和胚珠的发育［39］。SEP4 (SEPALLATA4)，在萼片、花瓣、雄蕊和心皮四轮花器官中均表达，SEP4 单突变体无表型变化，sep1sep2sep3sep4 四重突变体的花同源异型转化为叶片类器官，E 类基因的功能扩展到第一轮，表明E 功能基因参与调控四轮花器官和花分生组织的决定性［40］。王静澄等［41］在毛白杨中得到SEP3 基因启动子的部分序列，序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA－box 和CAAT－box，还包含大量光响应元件ACE、Box I 和Box 4 等，此外还有脱落酸响应元件ABRE，赤霉素响应元件GARE －motif 以及胁迫响应元件HSE、TC － rich repeats等，为该基因启动子的研究奠定基础。

对植物花发育分子生物学的研究成果倍出，主要集中在花发育相关基因序列的克隆，基因功能和表达分析，启动子序列获得以及转基因研究。模式植物，如拟南芥、金鱼草、杨树的开花基因研究比较全面，近年来在果树，林木等木本植物中开花基因的研究成为热点，研究经济林木成花基因，可为缩短经济林木童期、实现花芽分化调控、提高木本果树果实品质和产量提供依据，但在这些方面还有很长的一段路要走，各种研究仍在艰难的探索中。

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