硫化氢生物学功能的研究概况

王茂先

（韩山师范学院生物系，广东潮州 521041）

硫化氢（Hydrogen Sulfide，H2S）是一种具有臭鸡蛋味道的有毒气体，也是继一氧化碳和一氧化氮之后的第三种气体信号分子.胱硫醚β-合成酶（Cytathiohineβ-synthase，CBS），胱硫醚γ-裂解酶（Cytathiohineγ-lyase，CSE）及3-硫基丙酮酸硫基转移酶（3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase，3MST）可利用半胱氨酸或者同型半胱氨酸生成H2S[1-3].H2S作为生理介质，起初，在大脑中发现内源性的硫化氢[4-6].虽然重新评估的硫化氢含量是远低于最初的报道值，但是组织中存在硫化氢的这一发现还是得到证实[1，7].硫化物中毒的幸存者通常患有记忆丧失，这表明生理条件下H2S可能参与记忆的形成.H2S促进海马的长时程增强效应（Long-term Potentiation，LTP），记忆形成的突触模型，通过增强N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的活性[1].在此基础上，以及额外地发现胱硫醚β-合成酶（CBS）是在脑中表达，H2S被认为是一种神经调质.一氧化氮（NO）被发现作为内皮衍生血管平滑肌松弛因子[8]，后来发现也在大脑中活动[9].根据相关研究，H2S能够舒张血管平滑肌、回肠、门静脉，CSE或者CBS可能在这些组织中表达，也可能两者同时在这些组织中表达[7].H2S作为一个平滑肌松弛剂而起作用[10].

研究人员发现了H2S的细胞保护效应.H2S能保护神经元免于氧化应激造成的损伤，是通过恢复谷胱甘肽水平降低氧化应激的损害[11].尽管H2S清除活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的效率不及由H2S诱导谷胱甘肽级联放大效果，但是这种清除作用也有助于神经保护效应[12，13].这些发现引起了H2S对心血管保护作用的认识，以及H2S维持线粒体对缺血再灌注损伤的保护作用[14].H2S的细胞保护作用也能够在细菌中观察到.由细菌中的CBS、CSE、3MST三种酶的类似物所产生的H2S，被发现是一个参与细菌耐药性的关键分子[15].H2S的细胞保护作用是一种普遍存在的从细菌到哺乳动物防御机制.同时，H2S能够在哺乳动物细胞和多种不同组织中通过上述三种酶的表达而产生，具有多种多样的生物学功能.这些研究成果引起了越来越多的科研工作者重视，开展了广泛而深入的研究工作，并取得了丰硕的成果.

1 硫化氢的产生及其释放机制

硫化氢能通过5’磷酸吡哆醛依赖产生的酶，包括CBS、CSE和3MST.CBS和CSE的分布具有一定的组织特异性，CBS主要存在于中枢神经系统[1，16]，而CSE则主要存在于心血管系统[17，18].CBS和CSE在许多组织（包括肝、肾）中表达[1，19-21].虽然CSE在脑中表达是有争议的，但是有报道发现CBS和CSE在脑中表达，通过半胱氨酸产生硫化氢[7，22-25].CBS和CSE也催化半胱氨酸合成同型半胱氨酸的缩合反应产生硫化氢[25，26].通过CBS产生硫化氢受限于S-腺苷甲硫氨酸构象活性变化的范围，同时，在高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia）的情况下，CBS的作用减弱[27，28].

CBS在肝、肾、脑、子宫、胎盘、胰岛等器官中表达.在脑中，CBS主要局限在小脑的贝氏胶质细胞和星状胶质细胞[29，30].CBS局限在胚胎早期发育阶段的心室带神经上皮细胞，但是在胚胎后期和新生儿时期，CBS出现在放射状胶质细胞和星状胶质细胞.星状胶质细胞的CBS的表达通过EGF、TGF-α、cAMP和地塞米松而增强[29，31].除了CBS的转录上调，CBS激活剂S-腺苷甲硫氨酸增加硫化氢产生酶的功能而产生硫化氢[32].CSE通过半胱氨酸或者同型半胱氨酸产生硫化氢.在通常情况下，大约70%的硫化氢是由半胱氨酸产生的，剩下的30%硫化氢由同型半胱氨酸产生的.然而，在较高浓度的同型半胱氨酸存在的情况下，是同型半胱氨酸，而不是半胱氨酸成为合成硫化氢的首选底物的来源[26].

CSE在肝、肾、胸主动脉、回肠、门静脉、子宫、脑等中表达，也在胰岛和胎盘中表达[22，24，33-35].CSE的表达由于NO供体，S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）的含量增加而增强.与此同时，CSE的表达也由于NO另外一个供体硝普化钠（Sodium Nitroprusside，SNP）的含量增加而增强，尽管NO对CSE的这些作用是有争议的[21，26].尽管要求Ca2+的浓度较高（1 mM），最近的一项研究表明CSE的活性通过钙调蛋白来调节[19].CSE和钙调蛋白的相互作用通过EGTA和钙调蛋白抑制剂W7而终止，CSE活性增强可以通过其与钙调蛋白直接绑定而作用[36].

通过CBS基因敲除的小鼠脑匀浆中硫化氢含量分析发现，硫化氢依赖于α-酮戊二酸盐的存在而由半胱氨酸产生.这些实验结果表明在脑中有另外一种硫化氢产生酶，既不是CBS，也不是CSE[3].3MP的存在，仅仅牵涉到巯基乳酸半胱氨酸二硫化合物（3MP的一种代谢产物）的释放成尿[37-39].实验观察甚至发现，在没有3MP增加的情况下，也存在这种产生硫化氢的途径，这表明3MP是作为中间代谢物而存在.3MST存在于肝、肾、心脏、肺、胸腺、睾丸、胸主动脉和脑中.伴随有CAT的3MST高效地由半胱氨酸和α-酮戊二酸盐而产生硫化氢，同时这种产生由CAT或者AAT首选的底物天冬氨酸产生竞争性抑制[3，40，41].

在pH 8.4时，细胞中主要的还原性物质谷胱甘肽和半胱氨酸处于生理浓度，硫化氢从培养的神经元和星形胶质细胞中释放出来.因为硫酰化硫在碱性条件下比生理条件下的还原性大得多，在pH值高于8.4时观察到硫化氢释放[42].虽然系统的pH值在碱性或者酸性条件下大约变化为0.2，pH值在局部的变化可能更大些.当神经元兴奋时，Na+进入细胞，K+流出细胞，导致细胞外有高浓度的K+.神经元周围的星形胶质细胞的细胞膜去极化，同时激活Na+/HCO3-协同运输[43].HCO3-进入细胞引起细胞的碱化.虽然因此而生成的硫化氢还没有被发现，大约10%的原代培养的星形胶质细胞对10 mM K+有反应，而使细胞内的pH值增加到8.4[42].研究表明，PI3K/Akt途径通过Sp1来调节CSE的表达，这一点对于理解PI3K/Akt和CSE在肿瘤发生中起作用是特别重要[44].新近研究表明，硫化氢代表了在T淋巴细胞中是一种新颖的自分泌的免疫调节分子[45].

2 硫化氢与血管舒张的关系

通过胸主动脉、门静脉和回肠等处所生成的硫化氢，能够被CSE抑制剂所抑制，而硫化氢舒张这些组织.舒张最可能是通过非ATP联系的方式打开K+-ATP通道[7，28].CSE突变引起小鼠的高血压，表明硫化氢是一种血管平滑肌松弛剂，可以调节血压[19].最近的报道，硫化氢能够调节阴茎海绵体平滑肌的舒张[46].同时，内源性硫化氢也能够对大鼠阴茎海绵体产生神经性舒张[47].CBS和CSE都能够在人类阴茎组织中表达，人类阴茎的匀浆能够产生硫化氢.应用外源性硫化氢和半胱氨酸能够引起人类阴茎海绵体产生一种浓度依赖式的舒张.半胱氨酸诱导的舒张能够被CBS抑制剂氨基氧乙酸（Aminoxyacetic Acid，AOA）所抑制.在大鼠中，硫化氢和半胱氨酸促进阴茎的勃起，这种对半胱氨酸的反应，被CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸（DL-Propargylglycine，PAG）所阻断.在人类和其它哺乳类中，硫化氢/半胱氨酸途径可能涉及调节阴茎的勃起.硫化氢及其合成酶在人类前列腺腺组织和细胞由双氢睾酮进行调节，这表明硫化氢可能对前列腺疾病有一种潜在的治疗作用[48].

CSE也被NO所增强.CSE含有12个潜在的S-亚硝基化的半胱氨酸残基，可以增强CSE的活性[49].通过移去内皮细胞后、使用一氧化氮合成酶的阻断剂或者Ca2+所依赖的K+-ATP通道的阻断剂，硫化氢诱导的血管舒张可以部分地被减弱.这表明硫化氢可能刺激内皮细胞释放某种因子促进平滑肌的舒张[50].在离体再灌注大鼠的肺中，硫化氢合成速率对于减轻急性缺氧性肺血管收缩反应的程度大小，能够发挥一定的作用[51].据报道，Cinaciguat是一种新型的诱导硫化氢产生的分子，并且对缺血/再灌注的心脏具有强有力的保护作用[52].外源性硫化氢能够通过抑制内质网的氧化应激（Oxidative Stress，OS），发挥对由阿霉素引起的心肌细胞中毒的保护作用[53].

O2调节对硫化氢诱导的血管舒张的敏感性.在生理的O2条件下，硫化氢能够对大动脉产生舒张作用.在高浓度O2下，引起大动脉的收缩；而在生理低浓度的O2下，硫化氢诱导快速大动脉的舒张[49，54].通过激活人体皮肤角质化细胞的NF-kappa B-COX-2途径，氧化应激作用能够调节化学所诱导缺氧损伤和炎症[55].小口径和管壁厚的外周血管比由胶原组成的主动脉含有较多的平滑肌，有更多O2的消耗，然而在外周的O2的含量较低.相比主动脉，外周动脉通常在较低的O2浓度时，释放硫化氢.由游离的NO引起的血管组织中的S-亚硝基化，也可能导致血管腔的扩张[56].硫化氢在以O2浓度依赖的方式催化从S-亚硝基谷胱甘肽上释放NO.实验结果进一步说明硫化氢和NO之间的相互作用[49].与NO供体（SNP）混合的硫氢化钠抑制NO的活性而舒张平滑肌，例如，硫化氢可能通过清除内源的NO，而增加大鼠的中间动脉的压力[57].硫化氢预处理能够抑制由单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）诱导的主动脉的舒张[50].研究表明，H2S/CSE信号通路，可能提供潜在的心血管疾病的治疗靶标.但是，硫化氢作为分子靶标还有待于进一步的鉴定[58].

由于硫化氢，在内皮存在的条件下，对血管平滑肌的舒张效应没有影响或者稍微增强，所以应用外源性硫化氢可以刺激内皮细胞释放内皮源性舒张因子（EDRF）或者内皮源性超极化因子（EDHF）[59]以及引起它们之间的相互作用[7，21，60].因为硫化氢在内皮移除后，显著地舒张血管组织，内皮对应用外源性硫化氢舒张效应的作用一定很低的[7，50].在CSE和CBS中，一个酶的活性缺少，是可以通过另外一个酶的活性得以补偿，从而维持内源性硫化氢的水平.然而，两者其中任何一个酶的调节系统缺陷和肾血管阻力将导致肾脏高血压的形成[61].硫化氢调节大鼠的血压过程中，CSE和CBS之间的作用是相互依存的[61].

EDRF与NO具有不一样的特性[62].NO舒张非血管平滑肌，但是从培养的内皮细胞释放的EDRF不能舒张非血管平滑肌[63].EDRF的活性通过阴离子交换树脂后丢失的，而NO不会丢失.另外，EDRF使平滑肌超极化，但是NO没有这种效应.这些实验数据表明EDRF由一种以上的组分构成.引起平滑肌的膜超极化的组分是EDHF不可缺少的组分之一.虽然硫化氢和EDRF的相似的性质（产生硫化氢的主要的酶CSE局限在平滑肌上），它也没有被认为是EDRF的组分之一[7，21，59].虽然物种不同，但是最近报道CSE在小鼠、牛和人类的内皮细胞上表达[19].在大鼠中，Western免疫印迹（Western blotting）分析和免疫组织化学显示，3MST和CAT局限在脑中血管内皮细胞上[3，40].在α-酮戊二酸盐存在下，内皮细胞裂解液以3MP作为一种底物以及由半胱氨酸产生硫化氢.由于内皮细胞产生硫化氢，高度依赖与α-酮戊二酸盐，伴随CAT产生的酶是3MST，而不是CSE.3MST可能是一种在内皮细胞中产生硫化氢的主要酶，至少，大鼠是这样.所以说，硫化氢是一种EDRF的“候选者”[3，36].

3 硫化氢与抗氧化应激的关系

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激如缺血再灌注、炎症性疾病中病原微生物所产生的脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）时[45]，体内高活性分子如过量活性氧（ROS，包括H2O2、OH·及O2-等）等产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤.ROS能够引起脂质过氧化、蛋白质变性、基因表达异常，最终导致心肌损伤甚至引起个体死亡[64-67].因为过多ROS能损伤核酸、蛋白质及膜磷酸酯，导致心肌细胞、神经细胞等损伤.然而，体内外的抗氧化剂可以减缓氧化应激给机体所带来的危害.由于硫化氢本身就是一种还原剂，容易与过氧化氢反应[68]，因此硫化氢可直接清除ROS[69，70].硫化氢抗氧化作用，可能与增加谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的生成有关.GSH生成由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-Glutamylcysteinesynthetase，γ-GCS）及谷胱甘肽合酶（Glutathione Synthase，GS）催化.硫化氢可通过增加γ-GCS活性及半胱氨酸的转运等机制增加GSH水平，从而发挥其保护神经元对抗谷氨酸引起的氧化应激所造成的损伤[11].硫化氢也能够促进GSH的再分配，使其进入线粒体增多，有助于发挥对心脏和神经等的保护作用[12].

由于硫化氢是一种有效的抗氧化应激物质，在异丙肾上腺素诱发的缺血心肌中，硫化氢能够抑制丙二醛、脂质共轭烯等过氧化脂质生成[71].缺血再灌注或阿霉素中毒消耗细胞内大量GSH，补充外源性硫化氢（NaHS作为硫化氢的供体）则使GSH含量及γ-GCS、GS、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性升高[11，72].表明硫化氢能通过促进内源性抗氧化物生成，间接地清除ROS.这种效应通过核因子E2相关因子2（Nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）介导，补充适量硫化氢24 h后，小鼠心肌胞浆内Nrf2逐渐减少、核内Nrf2逐渐增多.血红素加氧酶1（HO-1）、硫氧还蛋白、铜锌超氧化物歧化酶、锰超氧化物歧化酶表达上调.Nrf2基因敲除小鼠上述内源性抗氧化物表达明显减少，SP作用消失[73].在谷氨酸处理胚胎大鼠原代培养大脑皮层神经元建立的氧化应激损伤模型中观察到，外源性硫化氢呈剂量依赖性的抑制谷氨酸兴奋性毒性作用引起的神经元死亡，使细胞存活率升高，因此硫化氢具有神经元保护作用[11].硫化氢能保护小鼠海马神经细胞株（HT22细胞）对抗氧化应激引起的损伤[74].硫化氢也能保护神经细胞对抗次氯酸及过氧化亚硝酸盐诱导的氧化应激损伤[13，75].

硫化氢能够保护具有神经元形态与功能特征的PC12细胞对抗β-淀粉多肽（Amyloidβpeptide，Aβ）参与老年性痴呆（Alzheimer’s Disease，AD）的发病过程中，引起的氧化应激损伤[69].血浆高水平的同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是AD的危险因子，控制Hcy的神经毒性已成为防治AD的重要策略.Hcy可抑制神经细胞内源性硫化氢的生成，而外源性硫化氢可拮抗Hcy的氧化应激和神经毒性[76，77].氧化应激损伤被认为是帕金森氏病（Parkinson’s disease，PD）的一个极为重要关联因素，与损伤黑质多巴胺神经元（Dopaminergic Neurons）有关.硫化氢能减轻鱼藤酮诱导的大鼠PD的症状及黑质多巴胺神经元变性，并抑制鱼藤酮对小胶质细胞的激活作用.在鱼藤酮诱导的大鼠PD模型中，发现的硫化氢的神经保护作用与在人多巴胺神经细胞瘤株（SH-SY5Y）观察到的实验结果相一致，即硫化氢抑制鱼藤酮引起的神经元凋亡.研究表明，吸入硫化氢可以阻断PD动物的神经退行性病变和运动失调[78，79].

4 硫化氢与炎症的关系

硫化氢在炎症过程（Inflammation Process）中有一定的影响，甚至可以作为一种炎症反应（Inflammatory Response）的生理指标，从而在一定程度上，发挥抗炎和辅炎的生物学效应[80].在内毒素病症中，硫化氢生成的增加，可以作为器官伤害的病理学指标.硫化氢生物合成的抑制也许可以作为一种治疗脓毒和休克所引起的器官损伤的有效措施[81].CSE表达的抑制和辅炎组分硫化氢形成的减少，导致在脓毒病症过程中产生类似地塞米松的抗炎效应（Anti-inflammatory Effect）[1].在内毒素休克过程中，硫化氢生成的增加涉及到肺组织的损伤过程[82].在关节炎病症中，硫化氢可能产生一种新颖的细胞保护内源性机制[83].血小板源生长因子通过Nrf-2的氧化还原的活化作用而介导CSE的调节，可能有助于肾小球炎性疾病的治愈[84].

在用脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）作为试剂研究炎症模型实验中，LPS明显影响H2S/CSE的表达，从而在一定程度上，发挥减轻炎症症状等保护作用.在注射了LPS的小鼠和大鼠模型中，NO和硫化氢两者的生物合成增加[85].LPS对内皮细胞相关的血管舒张具有抑制效应，而导致肺动脉高压，此作用可能与H2S有关[86].H2S/CSE的表达下调，涉及到由LPS诱导的急性肺损伤的发病机理.内、外源性硫化氢对急性肺损伤提供一种保护作用，是通过硫化氢的抗氧化效应和由肺的中性粒细胞所诱导的炎症过敏反应的减轻[87].LPS能够促进CSE的表达和硫化氢产生量的提高[88].在阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）模型大鼠研究中，通过NF-kappa B通路的抑制作用，能够减少辅炎因子的过度表达，硫化氢减弱LPS导致的认知能力损伤的程度[89].吸入硫化氢的方法，是通过改变小鼠体内的硫代谢来预防提高了LPS处理而引起炎症小鼠的存活率[90].

硫化氢能够抑制LPS刺激的巨噬细胞中NO的产生和NF-kappa B的激活[91].S-炔丙基半胱氨酸（SPRC）阻止LPS诱发的大鼠海马中的硫化氢水平，在抑制NF kappa B p65转录因子磷酸化中提供了有利的作用[92].通过部分地削弱Ikappa B alpha/NF-kappa B信号途径和激活PI3K/Akt信号途径基础上的H2S/CSE途径，SPRC在LPS诱导的H9c2细胞上发挥抗炎效应[93].在T淋巴细胞中，硫化氢能够作为一种新型的自分泌免疫调节分子[45].在小鼠急性胰腺炎模型研究中发现，SPRC对急性胰腺炎产生一定的有益作用，可能是通过减缓内源性硫化氢的释放，并对CSE的表达可能存在一种负反馈的调节机制[94].

5 展 望

H2S作为体内重要的气体信号分子在生命活动中有重要的生理调节作用.H2S是由CBS，CSE和3MST等三种酶产生的.H2S可能在这些酶中释放出来之后，就立即作为信号分子而发挥作用；也会以固定形式的硫烷硫储存起来，当细胞收到一定的生理信号刺激时，转而释放出H2S.H2S有时候会出现对比效应（Contrasting effects），相同浓度的H2S对不同组织会产生不同的生理效应[10，36].除了对离子通道、受体和一些酶的直接激活或者调整这些酶的活性，H2S也通过细胞内的信号来调节一些酶的活性[12，95].一些被认为是由H2S诱导的实验结果，可能是由其它形式的含硫化合物所诱导的[96，97].为了建立H2S作为一种生理介质而存在，并确定针对由于H2S涉及的疾病治疗的适当措施，就必须搞清楚上述这些问题.D-半胱氨酸的使用，能够保护原代培养的小脑细胞免于由H2O2诱导的氧化损伤，并且比L-半胱氨酸更能够减轻肾脏的缺血再灌注损伤.这些H2S产生的新途径为将H2S传送至特定组织中提供新的治疗方法[10].

最近的研究发现，一定浓度的外源性H2S、过氧化氢（H2O2），能够在转录、转录后以及翻译水平上调节哺乳动物细胞的CSE的表达[98，99].起初，H2S的细胞保护效应在哺乳动物的大脑和心脏中发现，随后在其他组织中也发现这种现象[11，13，14].研究也发现，哺乳动物细胞CSE能够通过转录和转录后调节，对缺氧做出应答.在一定程度上，CSE基因的表达能够被缺氧所调节[100].由于CSE基因主要在心血管系统中表达及其与心血管疾病发生的密切关系说明，CSE基因表达调控机制的研究，在心血管疾病研究中具有非常重要的理论和临床应用的价值.因此，深入开展CSE基因表达调控方面的研究工作，不但可以阐明相关疾病发生的分子机制，而且能够发现不同的外源性因素如何调控CSE基因的表达，很有可能找到相关疾病发生的分子机制和药物作用的新靶标.

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