DNA分子标记在动物保护生物学中的应用

任 艳 魏 磊

（宿州职业技术学院 安徽·宿州 234101）

保护生物学要解决的首要问题是人类面临的一系列生物多样性危机的原因和需要加以保护的问题。 遗传多样性是种上水平各类多样性来源的基础，也是保护生物学研究的核心内容。 对于稀有种、特有种和小种群来说往往出现遗传上的衰退， 即遗传多样性的降低。 造成遗传衰退的原因有选择作用、群体有效大小降低、遗传漂变以及自交等等，较低的遗传多样性会导致较低的环境适应能力和易受到环境突变的影响。 因此，从分子水平上检测其近亲繁殖的程度、基因流程度、种群间的杂交和基因渗透情况，对保护物种的遗传多样性具有重要意义。 目前，物种正以惊人的速率消失， 这种非演替性的灭绝正在不断减少物种的多样性。 2004 年3 月出版的《科学》杂志上发表的英国野生动物调查报告称， 一直被认为是由很强恢复能力的昆虫也和众多大型动物和植物一样，正在面临灭绝的命运，比如蝴蝶，其物种灭绝速率甚至比鸟类还大， 拯救物种是保护生物学的紧迫任务。 保护生物学研究的重点在小种群问题，主要是对已经变小的种群进行妥善保护。 研究的焦点集中于种群动态或遗传变异相关的问题， 关注导致生物多样性危机的原因， 寻找减轻或消除威胁物种继续生存的胁迫因子。DNA 分子标记技术的出现，为保护生物学的研究提供了可靠的研究方法， 是研究种群遗传多样性、近交衰退问题、分析种群的遗传结构和适应潜力、分类和系统进化等的有力工具。 目前，常用的分子标记有限制性片段长度多态性（RFLPs）、随机扩增多态性 （RAPDs）、 特异性扩增长度多态性（SAP）、小卫星DNA、微卫星DNA（SSR）等。

一、DNA 分子标记在动物保护生物学中的应用

（一）种群遗传多样性检测

微卫星DNA 分子标记技术是物种遗传多样性分析中非常有效的分子标记。 微卫星，又称简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）。其重复单位碱基数目一般为1-6 个，如（C A ）n，（CAG）n 等（Cao et al 2004）。 微卫星重复序列在群体间和不同的个体间通常表现出很高的序列变异性， 并且这种变异呈共显遗传， 因而微卫星重复序列广泛应用于物种遗传多样 性 分 析 （Hadonou et al.，2004；Romero et al.，2003）、连锁图谱制作（Staten et al.，2004）疾病连锁分析（Sakurai et al.，2004）和家系标识（Selvamani et al.，2001）等研究。 由于微卫星DNA 标记突变率高、多态性强，因而非常适于分子生态学研究，而且，作为一种离散型数据信息，微卫星具有较多的等位基因，为分子水平上的种群遗传研究提供了许多便利， 如个体鉴定、亚种鉴别、种群结构估测以及种群演化的历史 分 析 等 （Cottelli et al.，1994；Taylor et al.，1994；Chan and Arcese，2002；Wimmer and Kappeler，2002）。如吴孝兵等（1999）通过对饲养种群的家系和有效种群的大小分析发现扬子鳄饲养种群子代鳄已显示出近交衰退迹象， 导致遗传多样性降低并提出了以下管理措施：1）要尽快了解扬子鳄种群的遗传结构，包括全国各地小种群的遗传多态性情况， 尤其要了解两个饲养的野生种群的遗传现状。 2）掌握扬子鳄偶带中的近交系数，确定鳄在自然状态下的交配系统，是一雄多雌，一雌多雄，或是单配性。 3）指定合理的遗传管理，以避免近亲交配，提高种群的繁殖质量。4）对野生个体要制定严格的保护措施，严禁扑杀。 5）尽快掌握所有繁殖种群的性别结构， 确定繁殖种群的性比例。 针对扬子鳄目前的遗传现状， 黄磊等（2004，2005）采用微卫星DNA（SSR）多态分析及使用SSR 和mtVNTR 分子标记对扬子鳄遗传多样性进行了研究，结果显示，在微卫星水平上扬子鳄种群表现出很低的遗传多样性。 基于此建议：把扬子鳄作为一个整体加以保护，在建立新的繁殖群体时，应考虑保存物种遗传多样性所必需的有效种群的大小， 在遗传管理上应注重低频等位基因的发现和保持。 在繁殖群体中人工选择遗传差异较大的雌雄个体配对繁殖，可最大限度地避免近交。Menotti-Raymond（1993）利用mtDNA 和高度可变地小卫星VDTR 对猎豹地两个亚种的遗传多样性进行研究，结果表明：两个亚种呈中等水平的遗传变异，支持猎豹大约在10 万年前产生瓶颈效应的假说。 潘登等（2005）对川金丝猴群体的微卫星多态性进行了研究年，检测了来自于3个川金丝猴主要栖息地的32 个样本的14 个微卫星座，在这些微卫星座上检测到了多态；而基于线粒体数据比较结果表明：川金丝猴的遗传多性水平较低，仍需要采取有效的遗传保护措施。 雷初朝等（2005）利用蛋白质、RAPD 和微卫星技术， 对我国濒危保护动物——人工饲养朱鹮进行遗传多样性研究。 结果表明40 只朱鹮在4 对微卫星位点的平均杂和度为0.3760，平均多态信息含量为0.3382、平均等位基因数为2.075。 表明朱鹮人工饲养群体的遗传多态性比发现之初得到一定的恢复，但仍然比较贫乏。 另外，由于DNA 上的碱基排列顺序揭示物种的遗传信息，在检测物种遗传多样性时，DNA 序列分析是最好的分子标记。因此，DNA 测序是检测遗传多样性最彻底的方法。 另外，AFLP 标记在遗传多样性检测、群体遗传结构和遗传分化分析、 物种亲缘关系分析基因流测定等方面得到了较广泛的应用， 是一种较新的分子标记技术。

（二）确定物种分类地位

形态学、解剖学、化石证据等是传统分类学常运用方法， 但这些方法的准确性和可靠性易受环境因素及个体发育情况的影响。 而DNA 分子标记能从DNA 分子水平上揭示其内在的差异，因而DNA 分子标记在分类学上已被广泛应用。 如线粒体基因组结构中的控制区（control region）。 线粒体DNA D-Loop区由于不编码基因，其DNA 序列的进化速度在线粒体基因组中最快，碱基替换率比mtDNA 分子的其它区域高5-10 倍（赵兴波等，1997）。 它是群体遗传学研究中最有效和最灵敏的DNA 区域 （Zhang et al.，1996）。 目前主要集中在遗传多样性、系统进化、物种识别以及亚种或种群来源鉴别等研究领域。 宿兵等（1996）基于D-loop 区195bp 的序列并结合形态学方面的资料，对我国珍稀灵长类黑冠长臂猿11 个个体进行分析， 提出新的分类观点并将新分类中的3 个种和3 个亚种作为不同的进化单位（ESUs）进行保护和遗传管理， 以保护各类群在进化历史中积累的遗传变异及其进化潜力。 刘海等（2003）测定了37 只中国大陆梅花鹿不同种群mtDNA 控制区5 端351bp的序列，共发现23 个变异位点，定义了5 种单元型。分子变异分析表明， 中国大陆梅花鹿出现了种群分化，支持把分布于东北，华南和四川的梅花鹿种群归入各自独立的管理单元。 中国大陆、日本南部和日本北部的梅花鹿种群之间无共享单元型， 且每个种群的单元型分别组成单系群。

（三）探讨种群的系统发生关系

DNA 分子标记还可以用于种内、 种间乃至近缘属间研究。 特别是动物线粒DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）多态性分析是保护生物学和进化生物学研究地一个强有力地工具 （Wilson et al.，1985；Moritz et al，1987）。 脊椎动物线粒体基因组是共价闭合的双链DNA，长度在16.5kb，在新陈代谢、细胞程序性死亡、疾病、衰老等过程冲具有重要作用。 线粒体组结构简单，呈严格得母系遗传，核突变率高等特点，广泛用于分析动物和动物类群间的系统关系，使其成为一种有效的研究物种进化的遗传标记（Mindell et al.，1999；Kumazawa et al.，1999；Adalgisa et al.，2004；吴孝兵等，2003；张海军等， 2004；张亚平，1992；Zhang et al.，2001；周继亮等， 2001）。 线粒体进化速度快， 其基因的碱基替代率使单拷贝基因的5-10 倍 （Piko et al.，1976；Begenhagen et al.，1980；Michaels et al.，1982； Robin et al.，1988）。 所以线粒体DNA 一直是系统进化上一种很好的分子标记。 尤其对珍稀动物的亲缘关系、系统进化的研究，更显示出了强大的优势。 吴孝兵等（2003）对扬子鳄线粒体DNA 基因组进行全序列测定，其全长16746bp，在对全序列分析的基础上， 对12SrRNA、16rRNA 基因序列、 蛋白质编码基因序列及其合并数据用MP 法和ML 法构建系统发生树，结果表明：扬子鳄与密河鳄的亲缘关系较近，支持传统观分类观点，并指出钝吻鳄属的发生时间为74.9MaBP， 扬子鳄与密河鳄分歧的时间为50.9MaBP。 如刘忠权等（2004）测定了泽蛙线粒体基因组全序列并与其他的6 种两栖类进行详细的比较，同时选择11 种高等脊椎动物的线粒体全基因序列，以硬骨鱼作外群，用22 个tRNA 基因合并数据进行系统发生重建分析， 结果支持现生两栖类动物为单系群，并且有尾目和蚓蝾目尾为姐妹关系。Janczewski 等（1995）比较了17 种猫科动物和5 种食肉目非猫科动物的12SrRNA（358bp）和Cytb（289bp）基因的DNA 序列综合分析显示：1）较晚进化的豹属是单源的，由狮、豹、虎、雪豹、云豹和美洲豹组成。2）猎豹和美洲狮有新近共同的祖先。 3）亚洲金猫和非洲金猫不是姊妹群。 这些猫科动物间较近的分歧大约发生在100-1000 万年间。

（四）亲子鉴定

野外种群极度濒危物种，就地保护物种、饲养种群以及动物园内的动物繁殖所面临的最大问题是种群过小所带来的遗传问题。 为了评估自然交配和人工授精的相对成功率、 确定生殖能力强盛的雄性个体，防止或减少后代的近亲交配、建立科学可靠的遗传系谱等，需要鉴定这些未知的父子关系。 张于光等（2005）利用10 对多态性引物对27 只东北虎进行亲子鉴定， 结果成功地鉴定出7 个父子关系不清的后代。 这表明利用微卫星DNA 分子标记可以有效的应用于动物的亲缘关系的鉴定， 从而为有效地避免了近亲繁殖带来的种群遗传多样性降低的不良影响提供了理论依据。。

（五）评定栖息地的进化保护价值

Fuller 等（1997）基于mtDNA 控制区（D-loop）序列分析， 研究了澳大利亚东北部不同生态系统中的野兔种群的遗传模式，结果表明：在干旱地区，各种群间存在广泛的基因流，种群管理应在整个干旱地区展开；而在半干旱地区基因流很局限， 因此进行再分割的局限地方性管理更加合理。 白素英等（2004）采用RAPD对中国豹猫6 个群体进行遗传多样性分析，RAPD 聚类分析结果显示：豹猫的遗传变异相当丰富，且各群体的遗传变异相差较大。 6 个群体科分为4 支，黑龙江-山西为一支，对应于北方亚种；贵州-广西群体为另一支，对应于指名亚种；云南群体为第三支，对应于川西亚种；福建群体为第四支，对应于华东亚种。 前三支遗传多样性相当丰富，而福建群体遗传变异较低。其原因可能是福建的地理位置特殊，一面临海，三面环山，基因交流较少。 因此，建议豹猫的种群的管理应在东北、西北、川西展开，注意保护这三个地区种群的遗传多样性。 而对福建群体， 考虑基因流的影响应进行特殊管理。这正是用DNA 分子标记来评定栖息地的进化保护价值的意义所在。

二、前景与展望

现代分子生物学技术为我们提供了诸如RAPD、RFLP、AFLP、ISSR、SSR 等大量的可以在群体水平上分析遗传多样性的分子标记， 微观上的遗传数据与宏观上生态环境的变迁相结合， 使从机制上阐述了物种的保护途径和方法。 为防止物种的灭绝，解决小种群遗传多样性损失和近交衰退问题， 分析种群遗传结构和适应潜力， 物种和群落的长期保存等提供了有力的工具。 随着分子生物技术的不断发展，DNA分子标记的种类和数量将会不断的增加， 技术会更加成熟。 目前在分析种群的系统发生关系，确定种群的分类地位，尤其在解释不同分类水平的关系方面，核基因是非常有用的， 如在各种鸟类群的分类和食肉目系统发生的研究中， 核基因已显示它包含很多有价值的系统发生信息。因此，DNA 分子标记正在发展使用线粒体DNA 和核基因序列数据相结合的标记技术。

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