线粒体功能异常与肿瘤的生成

汤春铃，向仲怀，崔红娟

西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716

线粒体是真核细胞内一种重要的细胞器。1890年，德国生物学家Altmann通过光学显微镜在动物细胞中观察到线粒体的存在。随后人们对线粒体的结构、功能等方面的认识逐步深入。最初线粒体被认为是“细胞的动力工厂”，随后发现它也是细胞凋亡和自噬的关键角色以及核外遗传物质的提供者等，其实它在细胞中充当的角色并不限于此。比如线粒体功能障碍对肿瘤的发生起着重要作用。在分子、生物化学、代谢和遗传水平上，正常细胞的线粒体明显异于肿瘤细胞的线粒体，同时肿瘤细胞表现的无限增殖、抵抗凋亡、逃避免疫监督、侵袭与转移以及出现异常的代谢途径等标志性特征也都与其线粒体有着密切的关系[1]。

与肿瘤相关的各种信号通路、基因突变以及微环境等似乎都倾向于靶向线粒体功能的调节来参与肿瘤的发生进程。我们前期的研究结果表明，特异地抑制参与神经母细胞瘤增殖与生长相关的 Sonic Hedgehog信号通路可以激活线粒体参与的凋亡途径[2]；在结肠癌中，参与线粒体凋亡途径激活的 Bax蛋白在死亡受体介导的凋亡过程中是必需的[3]；除此之外，转录因子 N-myc能够通过与线粒体相关的信号途径参与调节神经母细胞的抗凋亡生物学特性[4]。

因此，深入研究线粒体功能异常在肿瘤细胞发生中充当的角色，对于认识肿瘤发生及发展这一多种信号网络交错调控的复杂过程，包括癌基因激活、抑癌基因失活、细胞调亡异常以及DNA损伤修复功能异常等方面，以及肿瘤的诊断与治疗都有着深远的意义。

1 线粒体代谢异常

1.1 肿瘤细胞能量代谢特点

有氧糖酵解是癌细胞能量代谢的标志之一。早在90年代Otto Warburg博士发现癌细胞中绝大多数的ATP是通过糖酵解产生的，即使在高氧条件下也能够上调糖酵解途径并产生更多的乳酸，这就是著名的 Warburg效应[5]。Warburg认为这种有氧糖酵解是肿瘤细胞的一个普遍性特点，而且肿瘤的发生是由于线粒体的代谢损伤引起的，因此可以通过抑制线粒体的氧化磷酸化，降低肿瘤细胞线粒体的活性，使其达不到存活所必需的能量值，最终达到消除肿瘤细胞。此外，大部分的肿瘤细胞能够通过增加葡萄糖的摄入来补充合成代谢的碳源。通过正电子断层造影术(Positron emission tomography，PET)，利用葡萄糖的类似物FDG (Fluorodeoxyglucose)可以在临床上明显地观察到肿瘤细胞大量摄入葡萄糖的现象，将FDG-PET和CT (Computed tomography)技术的结合，可使检测绝大多数上皮类型癌症转移方面的灵敏度和特异性达到90%以上[6]。

肿瘤细胞这种特异的能量代谢方式对于其适应不同的微环境、维持无限增殖以及远端侵袭能力、提供快速生长所需的合成代谢原料等各方面的特征是必要的。例如肿瘤细胞可以利用有氧糖酵解的主要产物乳酸来维持酸性环境、促进自身的侵袭以及抑制抗癌免疫有效因子等[7]；同时，分泌的乳酸可以通过单羧酸盐运载体被基质细胞吸收，并产生丙酮酸再次提供给癌细胞充当代谢原料[8]。更为重要的是，肿瘤细胞能够利用糖酵解途径产生的中间产物进行合成代谢，例如葡萄糖-6-磷酸可用于糖原以及核糖-5-磷酸的合成；二羟丙酮磷酸可用于三酰甘油和磷脂的合成；丙酮酸可用于丙氨酸和苹果酸的合成[9]。由此可见，肿瘤细胞为了适应自身生长的特点，对整个能量代谢途径进行了重编，以一种看似更为原始和简洁的方式进行，很显然，肿瘤细胞偏向这种无利可图的能量代谢途径不仅仅只是为了产生ATP。

1.2 线粒体代谢变化及分子调控机制

1.2.1 线粒体自身损伤

肿瘤细胞代谢重编的机制是复杂的，其中线粒体自身的损伤是其原因之一。肿瘤细胞的线粒体相对较小，缺少嵴，ATP合酶的 β-F1亚基受损，因此在氧化磷酸化方面表现出一定的缺陷。例如在肝癌的研究过程中发现，通过寡霉素抑制氧化磷酸化会引起糖酵解的快速增加，表明在线粒体产能受到抑制时，肿瘤细胞可以通过糖酵解进行产能[10]。但当糖酵解受到抑制时，肿瘤细胞却不能充分上调线粒体的氧化磷酸化水平，这说明了肿瘤细胞中存在部分的线粒体损伤[11]。另外，在肿瘤细胞中普遍存在着线粒体DNA突变，其中突变的mtDNA参与编码NADH脱氢酶亚基2，而该酶能够刺激有氧糖酵解、活性氧(Reaetiveoxygen species，ROS)的产生以及肿瘤的生长[12]。

1.2.2 HIF参与线粒体功能抑制

除了线粒体自身缺陷外，低氧诱导因子HIF也是线粒体功能障碍的一个主要因素。同时，HIF还是有氧糖酵解发生的主要因素，并受低氧压力、癌基因、炎症反应以及代谢和氧化压力等因素的影响。最近的研究表明，HIF-1除能上调对葡萄糖的利用起促进作用的酶的表达水平之外，还能抑制肿瘤细胞中线粒体的功能，这些都揭示了线粒体能够调节糖酵解与氧化磷酸化之间的反馈调节关系。此外，HIF-1还能抵消Myc对线粒体生物合成的刺激，从而降低线粒体的活性[12]；同时，HIF-1还能与c-Myc相互协作，通过诱导己糖激酶2 (HK2)以及丙酮酸脱氢酶1 (PDK1)的表达，达到促进有氧糖酵解的目的[13]。此外，在低氧条件下，HIF-1能调节细胞色素氧化酶COX的表达，使COX改变其亚基组成以使其达到最优化的活性：COX4-2亚基表达增加，而COX4-1亚基的表达由于线粒体蛋白 LON的激活而下降，同时COX4-1亚基能提高COX在有氧条件下的活性[14]。

1.2.3 p53与线粒体功能调节

近来的研究表明，p53除了作为细胞应激反应的中心调控者外，还能够调节糖酵解通路和线粒体氧化磷酸化之间的平衡[15]。p53诱导的糖酵解和凋亡调节因子 (p53-induced glycolysis and apoptosis-regulator，TIGAR)以及细胞色素C氧化合成酶2 (Synthesis of cytochrome c oxidase 2，SCO2)在该平衡调节中也起着关键作用，TIGAR的表达会降低细胞中果糖-2,6-二磷酸盐的水平，在抑制糖酵解途径的同时促进戊糖磷酸途径产生NADPH[16]。而SCO2与SCO1相互协调共同组装成细胞色素C氧化酶，当SCO2异常表达时可导致 ROS的增加，进而影响线粒体的氧化磷酸化功能[17]。这表明肿瘤中p53基因的突变会导致COX的缺陷，同时将能量代谢转移到有氧糖酵解途径，最终表现出线粒体呼吸作用的下降。

在肿瘤代谢重编过程中，线粒体可能是作为各种调控因子的作用靶点以及反馈中心，线粒体自身代谢功能的改变承接着肿瘤细胞所具有的代谢特性。进一步认识线粒体在肿瘤发生、发展过程中自身代谢功能的转变，以及其在肿瘤细胞代谢重编过程中所扮演的角色，将对肿瘤的早期诊断及治疗提供新的思路。

2 线粒体膜稳定性

2.1 线粒体膜稳定性变化

作为细胞凋亡内源途径中心位置线粒体，其膜的稳定性在凋亡过程中扮演着重要的角色。在一系列凋亡信号的刺激性下，线粒体外膜的通透性增加，随之释放出线粒体内的凋亡因子包括细胞色素C及其他蛋白因子，凋亡因子一旦进入细胞质就会和其他的衔接分子如凋亡蛋白酶激活因子 1 (Apaf1)、caspase-9前体等结合实现募集和激活，激活的caspase-9则对下游的caspase-3前体和caspase-7前体进行剪切和激活，caspases负责细胞内各种蛋白质的剪切，从而表现出一系列细胞凋亡的生物化学和形态学特点。因此，线粒体外膜的透化作用被认为是凋亡过程早期阶段的重要事件[18]。在凋亡过程中，线粒体膜的稳定性变化涉及到线粒体内外膜上一系列蛋白分子和膜上某些特异的结构变化以及膜内外参与调节的信号转导、激活、沉默等事件。

2.2 参与线粒体膜稳定性调节的信号分子

2.2.1 Bcl-2蛋白家族与线粒体膜稳定性

Bcl-2 (B淋巴瘤细胞蛋白 2)蛋白是从滤泡B细胞瘤中获得的第一个抗凋亡蛋白，位于线粒体的外膜上。目前，已有30种以上的Bcl-2家族相关蛋白被鉴定出来，包括 Bcl-2亚家族 (主要起抑制细胞凋亡的作用，如Bcl-2、Bcl-Xl、Bcl-W、Mcl-l等)，Bax亚家族 (主要起促进细胞凋亡的作用，如Bax、Bak、Bok等)，Bcl-2同源结构域亚家族 (主要起促进细胞凋亡的作用，如 Bik、Bad、Bid等)。当出现凋亡信号刺激时，起促凋亡作用的蛋白成员会改变细胞构型并参与外膜通透性的变化，从而激发促凋亡的活性[19]。在凋亡过程中，线粒体外膜透化作用的发生需要由Bax与剪切形式的Bid结合形成的寡聚式的Bax，而抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-Xl、Bcl-W等通过与Bax、Bak的前体结合，进而阻止凋亡前体蛋白发生寡聚化。因此，线粒体外膜上促凋亡蛋白与抑制凋亡蛋白间的平衡是凋亡是否发生的关键所在，在肿瘤细胞中这2种蛋白是不成比例的，进而抑制了凋亡的发生。

Bcl-2家族蛋白的不平衡可以通过电压依赖的离子通道 (Voltage-dependent anion channel，VDAC)间接地维持线粒体外膜的稳定。VDAC是线粒体外膜上的1种蛋白，主要负责线粒体和细胞质之间代谢物质的流通，当其受到刺激进而关闭时会导致ATP-ADP交换抑制以及通过线粒体膜的代谢物质减少，从而导致线粒体受损和细胞色素C释放，最终引起细胞凋亡[20]。而抗凋亡蛋白Bcl-xL通过维持VDAC的开放状态来抑制凋亡的发生。此外，近来的研究发现线粒体凋亡诱导通道 (Mitochondrial apoptosis-induced channels，MACs)也可以导致线粒体外膜发生透化作用[21]。位于线粒体外膜上的MACs为线粒体膜间隙中蛋白质等物质，特别是细胞色素C的流通提供了一种特异的通道。在某种程度上，MACs的通透性也表现出对Bcl-2家族蛋白的依赖性，MACs的必要成分中包括Bax，电生理特征与那些由Bax形成的通道非常相似，Bax的消耗会降低MACs的活性，同时Bcl-2的过表达则会阻止MACs的形成以及细胞色素C的释放[22]。

2.2.2 ANT参与线粒体膜稳定性的调节

腺苷酸转运载体 (Adenine nucleotide translocator，ANT)是线粒体内膜上最丰富的蛋白质，该蛋白除能催化线粒体产生的ATP与胞质中的 ADP进行交换外，还是线粒体通透性转换孔 (Mitochondrialpermeability transition Pore，MPTP)的关键成分[23]。MPTP可能主要由线粒体外膜的VDAC、内膜的ANT以及线粒体基质中的亲环蛋白D构成[24]。当MPTP处于开放状态时，由于小分子物质通过线粒体内膜使得内膜膜电位下降、外膜破裂以及基质肿胀，将最终导致一系列可溶性促凋亡蛋白 (如凋亡蛋白诱导因子)的释放并引起后续的凋亡反应[25]。对MDA-MB-231细胞的研究发现，转染 ANT1的细胞发生了凋亡，而转染ANT2则不会发生凋亡现象[26]。ANT1的过度表达伴随着膜电位的降低、细胞色素 C的释放等一系列凋亡反应，而ANT2的过表达对细胞则没有作用[27]。通过对经过改造的人类细胞系中表达的ANT亚型进行分析，发现其主要表达ANT2，而该亚型缺少ANT1具有的促凋亡活性[27]。这表明在肿瘤细胞中ANT2的过表达抑制了线粒体膜透化作用的发生，从而表现出抗凋亡的特性。

2.2.3 参与线粒体膜稳定性调节的其他信号分子

在线粒体膜稳定性的调节过程中，己糖激酶在保护线粒体免受外膜发生透化作用的过程中也起着重要的作用。在4种亚型 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)的己糖激酶中，Ⅰ型和Ⅱ型直接与线粒体结合的能力十分异常，其 N-末端序列是与线粒体结合的关键[28]。绝大多数的肿瘤细胞都能够特异地上调己糖激酶Ⅰ、Ⅱ的表达，它们在与VDAC的相互作用中占用了原本是凋亡前体蛋白在线粒体外膜上的结合位置，从而抑制了凋亡的发生[28]。同时，己糖激酶还能够参与MPTP开放的调节，己糖激酶Ⅰ型能够引发 VDAC的关闭从而抑制线粒体的活性，进而保护线粒体免于形成MPTP[29]。除此之外，肿瘤细胞表现的转录因子p53的突变缺失或者下调可能在抑制线粒体发生透化作用过程中发挥着重要作用。p53能够调节Bcl-2同源结构域亚家族蛋白的表达，上调凋亡调节因子 Puma和 Noxa，直接激活 Bax等，从而促进凋亡过程中线粒体外膜的透化作用[30]。因此，肿瘤细胞中p53功能的缺失将通过多种机制调节Bcl-2家族蛋白的水平进而促进线粒体膜的稳定性。另外，Akt/PKB通路的激活也能保护细胞免于凋亡。Akt的激活能够抑制 p53介导的Bax的表达，Akt的激活形式能够磷酸化凋亡前体蛋白Bad，阻止其与线粒体外膜相互作用[31]。而遗传证据也表明己糖激酶与线粒体的持续结合需要 Akt的参与，这种结合将促进己糖激酶与VDAC的相互作用，从而影响MPTP的开放状态[32]。

在肿瘤发展过程中，细胞逐渐表现出抗凋亡的能力，因此打破参与凋亡过程调节的信号分子之间的平衡，特别是凋亡早期阶段参与线粒体膜稳定性调节的信号分子，将有助于肿瘤细胞的抗凋亡能力的解除。

3 线粒体DNA改变

3.1 mtDNA

线粒体DNA (Mitochondria DNA，mtDNA)是人类细胞核外唯一的遗传物质，约有 10个基因拷贝，基因组为一含有16 569个碱基对的环状双链DNA分子。根据基因产物在CsCl中的密度分布，可将双链 DNA分子区分为一条重链 (H链)：含有编码 2个 rRNA (12S和 16S核糖体RNA)、14个tRNA以及12个蛋白质多肽分子基因 (共28个基因)；另一条为轻链 (L链)：含有编码8个tRNA及1个蛋白质多肽分子基因 (共9个基因)。所编码的13个蛋白为线粒体内膜上与氧化磷酸化有关的 5个呼吸链复合体中的 13个亚基，分别为：细胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚基，NADH脱氢酶的7个亚基，ATP酶的6、8亚基以及细胞色素b。除此之外，mtDNA上的D环区 (位于16 028 bp～577 bp)是主要的非编码区，控制着复制和转录。线粒体基因组在核基因的调控与指导下进行复制和转录并进行自主性的蛋白质翻译，最后与核基因编码的其余线粒体蛋白共同组成结构与功能完整的线粒体。

3.2 mtDNA变化

3.2.1 mtDNA突变

与核 DNA (Nuclear DNA，nDNA)相比，mtDNA所具有的独特结构及功能特点决定了其具有易损伤及突变的特点。如mtDNA几乎不含内含子序列，除控制区外，相邻的基因之间几乎无非编码基因；缺乏组蛋白及DNA结合蛋白保护；在细胞周期中合成能力活跃，但负责催化与复制的DNA聚合酶γ则缺乏校读功能；位于邻近氧化磷酸化的位置，易受到氧化损伤等。这些性质使其成为诱导细胞癌变的潜在因素之一。在肝癌研究中，Nomoto等发现所有的病人标本中出现了42%的C-tract缺失/插入突变，26%的错义、插入或者缺失突变，68%病人的mtDNA突变不出现于相应的非肿瘤区域的 D环区[33]；在头颈部癌变标本的研究中，Ha等发现早期癌前病变存在mtDNA的MSI变化，且随着病情的恶化，呈上升趋势[34]。同时在非实体瘤的研究中，Jannife等发现，白血病病人的肿瘤细胞中存在特异的mtDNA环状二聚体结构，并随着化疗药物的使用而减少[35]。这些都揭示了mtDNA在细胞癌变过程中可能是一个潜在的内因或者作用靶标，并为肿瘤细胞的维持包括增殖、代谢重编、抵抗凋亡等特征提供潜在动力。

3.2.2 mtDNA拷贝数量变化

在细胞癌变过程中基因拷贝数量的变化也是其中的一个标识，mtDNA拷贝数量的增多可能是一种满足肿瘤细胞快速生长对能量需求变化的适应性反应[36]。在肾脏肿瘤的研究中，Simonner等发现，肿瘤的侵袭能力与mtDNA的拷贝数量呈正相关，而呼吸链复合体V在肾肿瘤中的含量均有下降[37]；在甲状腺癌的研究中，研究人员发现线粒体同样表现出mtDNA含量的增加[38]。由此推断，氧化磷酸化产能或者呼吸功能的下降可能有助于肿瘤细胞增加生长及侵袭的能力，而mtDNA作为对其的一种适应性反应则表现出拷贝数量的增加。除此之外，拷贝数量的增加在一定程度上对原有的突变进行累积，为细胞进行癌变或者维持癌变状态蓄积了某种内在动力[39]。因此，充分认识肿瘤细胞中mtDNA的变化情况，通过选择性地诱导 mtDNA损伤，降低mtDNA的拷贝数量将有助于肿瘤的靶向治疗。

3.2.3 mtDNA与nDNA相互作用

mtDNA除了自身的变化可使其成为一种潜在的致癌靶标或内在标识之外，还能通过与核基因的相互作用激发细胞的癌变潜能。当细胞内外的有害因素积累到一定量时，大量损伤的mtDNA片段会从破裂的线粒体中释放出来，并随机地与核基因进行整合，这种整合可能会激活原有的癌基因或者抑制原有的抑癌基因，从而激活正常细胞进入癌变程序[40]。在细胞水平的研究中，Chen等发现在myc基因附近整合了一段源于mtDNA上几段不相连的基因连接而成的片段[41]；在动物模型实验中，研究人员发现鼠肿瘤组织中出现大量的类mtDNA片段整合到核基因中的现象[42]。这表明在进化过程中mtDNA与nDNA的相互作用为生物多样性的演变提供了内在的一个动力来源，而肿瘤的发生只是生物进化过程中多样性的一部分，这也是原始细胞引进线粒体提高代谢能力加速进化历程所需承担的风险之一。

4 ROS稳态变化

4.1 ROS来源

ROS是一类氧气代谢产物及其衍生的含氧物质的统称，具有比氧气更为活跃的化学性质，包括所有的含氧自由基和过氧化物。在真核细胞中大部分的 ROS是线粒体的副产品。在正常机体的有氧呼吸过程中，大部分电子沿呼吸链传递至末端与分子氧结合，在复合物Ⅵ的催化下氧气失去4个电子转变为2分子水。但是，电子传递链的其他氧化还原中心如复合物Ⅰ和Ⅲ能够漏出少部分的电子提供给分子氧，使其发生还原，生成具有较强氧化还原反应能力的超氧阴离子，成为细胞中超氧化物产生的最初来源。

4.2 ROS与肿瘤发生

适量的 ROS能够通过蛋白磷酸化/去磷酸化、相关转录因子及环鸟苷酸等相关途径参与细胞增殖、分化、凋亡相关的信号转导，并且在一系列水溶性和脂溶性的自由基清除剂及抗氧化剂的作用下得到及时清除，从而维持细胞的正常运转。当 ROS没有得到及时清除时，它将会通过氧化细胞的蛋白、脂质、核苷酸而最终导致细胞功能紊乱或者死亡。一系列病理学的研究表明：包括肿瘤在内的恶性疾病常表现出 ROS产生与抗氧化剂防御之间的平衡被打破。

在肿瘤发生过程中，线粒体不仅是 ROS的主要来源，也是 ROS的损伤目标之一。线粒体产生的 ROS能够氧化蛋白并引起脂质过氧化，从而降低生物膜的防护功能。ROS均能够促进依赖于Bax或者Bak以及MPT的细胞色素C的释放，细胞色素 C通过与心磷脂 (Cardiolipin)的静电作用和疏水作用结合在IMM的外部，而心磷脂的氧化会导致细胞色素C的分离[43]。这也许会为多种线粒体的抗氧化剂酶类的抗凋亡作用提供了一个可信的解释。

同时，mtDNA作为ROS损伤的另一个目标，由于缺少组蛋白保护、有限的修复能力以及极为接近主要自由基产生的位置，特别容易受到ROS的攻击。mtDNA编码的蛋白对线粒体呼吸链功能的完整性以及通过氧化磷酸化的方式产生ATP是必要的。因此，ROS对mtDNA的损伤最终将通过电子传递链的紊乱以及 ATP产生的缺失达到影响细胞的目的。同时，肿瘤细胞生长的低氧环境将会促进 ROS的产生，从而导致mtDNA损伤增加、呼吸链功能紊乱及ATP产生缺失，这又将进一步促进 ROS的产生，最终使肿瘤细胞主要依赖糖酵解途径产生ATP[44]。

在进化过程中，原始细胞通过引入线粒体捕获氧气实现了从最初的无氧呼吸到有氧呼吸的跨越式转变，有氧呼吸在提高代谢能力加速原始生物进化的同时，也承担着这一代谢方式的副产物 ROS所带来的损伤风险。因此打破肿瘤细胞中固有的 ROS稳态将有助于扰乱其正常的生理功能，从而进一步达到杀伤肿瘤细胞的目的，而这将基于对ROS来源及其平衡调节的进一步认识。

5 总结与展望

前面的讨论阐述了线粒体功能异常在肿瘤细胞发生形成过程中所扮演的特殊角色。在肿瘤的代谢重编中，糖酵解通路与氧化磷酸化之间的互反作用决定了肿瘤细胞的代谢取向。而其中涉及到的包括HIF、p53等在内的各种调控因子似乎都倾向于通过负调线粒体结构及功能来取得有氧糖酵解的优势，其作用结果将进一步抑制线粒体的正常功能。通过选择性的激活或者修复氧化磷酸化，打破以上这种有氧糖酵解占优势的现象，对于肿瘤的治疗仍然是一个原始的策略。同样的，线粒体的促凋亡作用与抗凋亡作用间的平衡在调节肿瘤细胞的生长方面也起着重要的作用。各种调节凋亡发生的因子在维持肿瘤的抗凋亡特征时都不约而同地选择了线粒体作为靶标。除此之外，mtDNA以及ROS在肿瘤的发生及特性维持过程中，线粒体不仅为其提供了原料及动力来源，还充当着靶标的角色。肿瘤的发生、发展作为一个多种信号网络交错调控的复杂过程，线粒体可能是这个网络中衔接上下游信号的中心，同时起着平衡肿瘤细胞内包括促凋亡与抗凋亡、糖酵解与氧化磷酸化、氧化损伤与修复等在内的各种代谢过程。因此对于癌细胞的杀伤及逆转必须基于这种平衡的打破，而其关键就是对线粒体的协调调节。充分认识线粒体在肿瘤发生中所扮演的角色将会促进特异杀死癌细胞以及抑制肿瘤生长的新治疗方案的发展。

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