增强DNA 疫苗免疫原性的研究进展＊

孟俊杰 综述 李婉宜审校

（四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室，四川 成都 610041）

DNA 疫苗又称核酸疫苗，是上世纪90年代出现的继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗。它是将含有编码抗原蛋白的DNA 序列的质粒载体作为疫苗，导入动物细胞后通过宿主细胞转录翻译出抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而使宿主获得相应的免疫保护，以达到预防和（或）治疗疾病的目的，在研究中逐渐显示出作为第三代疫苗的优势。

DNA 疫苗的优势主要体现在以下几方面［1-2］：表达抗原过程与自然感染相似，以天然表位提呈，没有表位构象的改变，能够更好地诱发产生中和性抗体；不需要再在体外表达和纯化蛋白质，制备简单，成本低廉，运输和保存方便；可以对新的病原变异迅速作出反应；可将编码不同抗原的基因构建在同一质粒中进行融合表达，制备多价DNA 疫苗，增强免疫效果等。研究人员还发现［3］，利用DNA 疫苗诱导产生的细胞免疫可杀死肿瘤细胞，若找到细胞恶性转化中的关键蛋白质，可以构建相应的疫苗打破免疫耐受或是引起免疫监视，这为抗肿瘤研究提供了新的思路。

1 DNA 疫苗免疫机制的研究现状

将含有目的基因片段的质粒导入宿主细胞以后，抗原编码基因在宿主细胞中表达出相应抗原，并呈递给宿主免疫系统，诱导机体产生免疫应答。这个过程与病原生物的感染过程很类似，因此宿主可同时产生细胞免疫和体液免疫［4-6］。

1.1 DNA 疫苗诱导的细胞免疫

质粒被肌细胞或者周围其他组织细胞摄取后，外源基因表达出相应的抗原蛋白，细胞中的水解酶将其降解为8～10个氨基酸的短肽。这些短肽片段在内质网腔中与MHCⅠ类分子的抗原结合槽结合成复合物，并经高尔基体转运至细胞表面。CD8+T 细胞识别抗原信号并被激活，增殖分化成为细胞毒性T 细胞（CTL），CTL释放穿孔素和颗粒酶杀死被感染的细胞，从而阻止感染的扩散。此外，CTL 还可通过产生细胞因子等非溶细胞机制来抑制病毒。也有人认为DNA 疫苗进入机体后，肌细胞和抗原提呈细胞均会被转染，使CD4+与CD8+T 细胞同时被激活从而产生免疫应答［7］。

1.2 DNA 疫苗诱导的体液免疫

激活B细胞需要分泌性和外源性抗原的刺激，因而抗原进入细胞表面或间隙是被B细胞识别的前提。研究表明［7］，在抗原蛋白诱发特异性抗体产生的过程中，完整异源抗原展示和胞外释放起了关键作用。Davis［8］等根据DNA 疫苗再次免疫后的反应程度、范围和破坏程度推测，抗体的产生可能与CTL 导致细胞溶解释放抗原有关。抗原蛋白被B淋巴细胞识别后，启动受体介导的内吞作用，最终抗原经水解成为免疫原性多肽，与MHCⅡ类分子结合后表达于细胞表面，激活CD4+T 细胞，并分化为Th细胞，产生大量细胞因子。在细胞因子的作用下。B细胞进一步活化、增殖、分化为浆细胞，开始合成并分泌抗体。

2 DNA 疫苗的优化

虽然DNA 疫苗具有减毒疫苗、灭活疫苗等无法相比的优点，但DNA 疫苗的动物试验研究表明，DNA 疫苗在小动物试验中获得了较好的免疫效果，可诱导机体产生较高的特异性抗体，对大动物而言，DNA 疫苗的免疫效果并不理想［9］。因此，使DNA 疫苗能在人体内诱导出较为理想的免疫反应是目前DNA 疫苗研发的重点。

2.1 DNA 序列的优化

在DNA 疫苗的构建中，通常选择病原体的结构蛋白和保守蛋白编码基因作为靶基因序列诱导保护性免疫应答，以避免病毒变异产生免疫逃逸。Billaut-Mu lot［10］使用能够编码HIV-1Nef的DNA 序列对小鼠进行初次免疫，再用HIV-1Nef蛋白加强免疫，结果显示免疫后小鼠产生了较强的体液和细胞免疫反应，对HIV 入侵有良好的保护作用。除此之外，对于易变异或者有较多血清型的病原体而言，多表位基因疫苗也是一种有效的应对手段。使用抗原表位做免疫原，可被有多种遗传背景的MHC分子识别、结合，从而获得高效的呈递。2006年，郭研等人［11］将从HBV 表面包膜蛋白和核心抗原中筛选出的一组抗原表位进行组合，构建了目的基因片断作为乙型肝炎特异的DNA 疫苗，用该疫苗免疫HLA-A2转基因小鼠，在小鼠体内诱导了很强的特异性T 细胞反应。目的基因的选择是DNA 疫苗能否获得良好免疫原性的关键，通过核酸序列的优化可使DNA 疫苗的免疫效果得到明显提高。

2.2 佐剂的优化

2.2.1 细胞因子佐剂

细胞因子是在机体免疫系统受到刺激时，参与免疫应答的细胞产生的小分子蛋白质，具有免疫调节的功能。使用细胞因子作为佐剂可增强疫苗的效果。白细胞介素2（IL-2）可促进T细胞生长分化，促进B细胞分泌抗体，增强NK 和CTL 的杀伤能力，可以作为一种天然免疫佐剂来使用。Kim 等［12］用编码HIV env／rev、SIV／pol蛋白的DNA 疫苗和含有IL-2基因的质粒共同免疫恒河猴，结果显示T 细胞介导的免疫效应得到了显著增强。沈肖方等［13］构建出以IL-2为佐剂的乙肝病毒前表面抗原（Pres1Ag）的真核表达载体，用基因枪免疫正常小鼠和HBV 转基因小鼠，结果显示80%的小鼠产生了抗乙肝病毒前表面抗原抗体，HBV DNA 量下降，20%的小鼠乙肝表面抗原转阴，说明此疫苗可部分打破小鼠机体的免疫耐受。干扰素（IFN）是由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，具有影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性，也是一种比较常用的细胞因子佐剂。Guo 等［14］将干扰素基因和弓形虫抗原DNA 用肌肉注射法免疫小鼠两次，每次100μg，间隔2周，与单独注射抗原DNA 的对照组相比，实验组T 淋巴细胞和NK细胞的活性都显著增加，IgG 抗体滴度也得到明显提高。

2.2.2 CpG 佐剂

CpG 是以未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）为核心的回文序列，5′端为2个嘌呤，3′端为2个嘧啶。研究发现CpG 在细菌基因组中的出现频率为1／16，在脊椎动物基因组中的出现的频率为1／50，并且甲基化率为80%～90%。脊椎动物的免疫系统正是通过识别未甲基化的CpG 而产生免疫反应。CpG 序列进入细胞的机制尚不清楚，多数学者认为它是通过细胞膜表面的一种非特异性受体进入细胞。Robert［15］发现CpG序列可与细胞表面的Toll样受体9（TLR9）结合，直接激活B细胞、巨噬细胞等免疫细胞。CpG 还可诱导单核细胞分泌IL-12 及其它细胞因子，活化NK 细胞和IFN-γ 的分泌。Koji-ma［16］将重组有HIV 外膜蛋白基因的DNA 疫苗与CpG ODN一同接种小鼠，观察到特异性细胞免疫应答和体液免疫应答均明显增强。Lipford等［17］研究发现弱免疫原蛋白OVA 与CpG ODN 一起免疫小鼠，IgG2a的含量显著增加了100倍，初始的CTL反应也得到增强。Weiner［18］等报道用CpG 序列的DNA作为免疫佐剂和一种淋巴瘤抗原共同免疫小鼠，发现免疫后的小鼠能够抵抗攻毒实验，而且CpG 佐剂的毒性远低于完全福氏佐剂。

3 接种方式的优化

目前，核酸疫苗的主要免疫接种途径有肌肉注射、粘膜表面涂布、基因枪及腹腔注射等。

3.1 肌肉注射

肌肉被认为是最有效摄取外源基因的组织，肌肉注射也是目前应用最广泛的免疫方式［19-20］。肌细胞可以通过T 小管或沟隙摄取外源DNA 分子，能够长期表达外源基因，引起MHCI型免疫反应，并且肌细胞的DNA 表达能力强于其他细胞［21-23］。但由于肌肉中缺少巨噬细胞等抗原提呈细胞，其抗原提呈能力差，注入的疫苗载体转染率偏低。因此，肌肉接种获得的免疫力通常随免疫次数逐渐增加。

3.2 粘膜免疫

粘膜是大多数病原体入侵的场所，粘膜抗感染保护作用的产生依赖于粘膜局部和系统的免疫反应。粘膜相关性淋巴样组织（Mucosa-associated lymphoid tissue，MALT）是机体免疫系统重要的组成部分，它作为机体的防御屏障，能够保护机体免受外源性分子的损害。当MALT 接触大量外源抗原时往往会选择适宜的效应机制调，以避免过强的免疫反应造成自身组织的损伤。粘膜免疫不仅诱导粘膜免疫系统产生sIgA，还可以诱导全身特异性免疫，与其他途径相比，其免疫效果明显增强，副作用也较小。

粘膜免疫途径主要包括滴鼻，吸入，口服，直肠给药等，这种非侵入的免疫方式操作简便，无创伤，用药安全。近年来，粘膜免疫途径逐渐引起人们的重视。目前很多核酸疫苗如编码流感病毒血凝素的核酸疫苗、编码HIV-1包膜糖蛋白的核酸疫苗等经常直接通过鼻腔或阴道途径进行粘膜免疫［24］。Fenne-lly等［25］以减毒鼠伤寒杆菌作为载体将编码李斯特菌ActA 和溶胞素的两种基因通过口服免疫小鼠后诱导产生了显著的抗李斯特菌的细胞免疫和体液免疫反应。

3.3 基因枪

又称微弹轰击法，是指将含有目标基因的质粒包裹在金或钨颗粒上，利用高压加速装置将颗粒直接射入靶细胞内，从而实现基因转移［26］。该方法可迅速方便地转移基因，且不论细胞处于静止期还是分裂期均可进行基因转移。与肌肉注射法相比，基因枪所需DNA 量要少得多。Fynan等［27］用基因枪法将甲型流感病毒的DNA 疫苗免疫小鼠，对比发现仅用0.4μg的DNA 免疫2次即可使90%的小鼠抵抗随后的病毒攻击，而肌内注射则需要100μg的剂量。沈肖方［12］等用基因枪肌注人IL-2和乙肝病毒前表面抗原的真核表达载体，与正常肌肉注射和皮下注射相比，100%小鼠在第4～6周测到了抗乙肝病毒前表面抗原抗体，且该抗体持续了10周左右，所需质粒量也仅为后者的1／10。但是由于基因枪对设备要求比较高而没有在实验中得到广泛运用。

3.4 腹腔注射

腹腔内有大量巨噬细胞，注入疫苗后可以迅速引起免疫应答，但是由于应答维持时间较短，转染效率低，获得的免疫保护效果比较差。

3.5 多途径联合免疫

研究表明［5］，多种途径联合免疫获得的免疫效果大于仅使用一种途径。如用疫苗进行初次免疫，重组病毒苗二次免疫，亚单位疫苗三次免疫可诱导机体产生高滴度抗体。注射疫苗之前，先用蔗糖溶液对接种部位进行预处理也能提高免疫应答水平。Fynan等［27］比较了甲型流感病毒DNA 疫苗经不同途径接种的免疫效果和保护率，结果无论是小鼠还是鸡，其免疫效果均以多种途径联合免疫为最好。

4 结语

DNA 疫苗是新型疫苗的发展趋势，众多研究表明流感病毒DNA 疫苗的免疫效果良好，其保护效果不逊于传统灭活疫苗。DNA 疫苗不仅有希望为现今难以治愈的感染性疾病提供有效的免疫保护，也可能在抗肿瘤方面发挥独特的作用。目前DNA 疫苗的潜在应用性得到广泛认可，美国已批准疟疾核酸疫苗的生产。虽然很多DNA 疫苗还处在实验室研究和Ⅰ期临床实验阶段，距离应用于临床还有漫长而艰难的道路，然而随着对疫苗的进一步研究，核酸疫苗将成为人类与感染性疾病及肿瘤抗争的重要武器。

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