MicroRNA与乳腺癌进展及耐药性的作用研究

刘振茹 周黎明

（四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室，四川 成都610041）

1 miRNA分子概述

miRNA作为一类特殊的内生性非编码小RNA，长度约为21－25个核苷酸，在多种生物中高度保守，可在转录后水平调控靶基因的表达。由于miRNA常以基因簇的形式存在，可存在于基因间隔区，或位于较大的非编码RNA分子内部，并且能够调节处于内含子区域的基因转录，因此，其对基因表达的调节作用也非常复杂［1］。miRNA的成熟，涉及到在胞核及胞质中的加工过程。首先在细胞核内，编码miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下生成pri－miRNA，经转录后修饰，增加5＇－端帽结构和3＇－端尾结构，然后在核酸内切酶Drosha和辅助因子DGCR8／Pasha的作用下，形成约70nt，具有茎环结构的miRNA前体pre－miRNA［2］。在核膜转运蛋白Exp5的协助下，从核内转运到胞质中，在胞质内经Dicer酶进一步加工后形成miRNA。

在细胞质中，成熟的miRNA可与RNA诱导的沉默复合体（RISC）整合，从而形成miRNA－RISC复合体，该复合体通过与靶mRNA的3＇－UTR区结合，裂解或抑制靶mRNA的翻译过程，从而诱导基因沉默。尽管miRNA诱导的基因沉默通常发生在靶mRNA的3＇－UTR区，但新的研究发现，miRNA可通过位于蛋白编码序列的种子序列及5＇－UTR区而调节翻译过程［3］。除此之外，一些非常规少见的关于miRNA上调靶miRNA的翻译也有报道。miRNA对mRNA翻译调节作用的复杂性，这也充分说明了其对基因组翻译调节的作用具有多重机制。

2 乳腺癌中异常表达的miRNA

miRNA已被证实与肿瘤的多种生物学特性具有相关性，包括增殖、分化及凋亡等过程紊乱。关于肿瘤相关miRNA表达谱的研究证实，位于脆性位点或扩增区的miRNA常异常表达，提示其可能参与肿瘤发生，从而作为肿瘤的生物标记物。

2.1 促进乳腺癌发生的miRNA

促癌基因miRNA在肿瘤中常上调表达，肿瘤抑制基因、细胞周期调节基因及利于疾病发生的其它相关基因是其潜在的作用靶点［4］。通过对miRNA表达谱的研究发现，miR－155在乳腺癌中过表达，并且在乳腺癌细胞株中过表达miR－155，可以促进细胞增殖及细胞集落形成，其功能的发挥通过抑制细胞信号因子1（SOCS1，而SOCS1作为肿瘤抑制因子可负向调控JAK／STAT信号通路［5］。Volinia等［6］发现，miR－21在多种实体肿瘤中过表达，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌等，提示其对肿瘤的作用可能具有普遍性。随后的研究证实，多种抑癌基因PTEN、PDCD4、TPM1是其作用靶点，可以介导细胞发生凋亡［7］。细胞转录因子ZBTB10／RINZF是一种调控细胞周期的特殊转录因子蛋白（SPl）的抑制物，而miR－27作为一种肿瘤癌基因，通过调节ZBTB10表达，从而使SPl蛋白过度表达，引起细胞癌变，miR－27也可使SP2和SP3过度表达，同样具有引起细胞癌变的作用［8］。

2.2 抑制乳腺癌发生的miRNA

抑癌基因miRNA在肿瘤中常下调表达或缺失，其作用的靶点为一些致癌基因。ErbB酪氨酸激酶受体家族对细胞的增殖及存活发挥重要作用，HER2／neu和HER3在乳腺癌中高表达，并且与乳腺癌预后不良相关，Scott等［9］研究发现，miR－125a和miR－125b可以抑制HER2和HER3的表达，并且在体外实验中，过表达miR－125a和miR－125b可以在转录及翻译水平降低HER2和HER3的表达，减少细胞增殖、侵袭及转移的能力，从而降低其恶性表型。研究还发现，miR－205在正常的乳腺上皮干细胞中过表达，并且在乳腺癌细胞系中以HER3为作用靶点，因此，在恶性程度较高的乳腺癌细胞中可发挥肿瘤抑制作用［10］。Cascio等［11］通过模拟 MCF－7乳腺癌细胞低氧环境，发现miR－20b能够通过调节 HIF－1（低氧诱导因子1）及STAT 3（信号转导及转录激活子3）通路，下调VEGF的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，起到抑癌基因的作用。

2.3 雌激素受体（ER）与 miRNA

雌激素受体（ER）的状态常作为乳腺癌重要的预后标志之一，通过对miRNA的表达谱研究发现，在ER阴性乳腺癌细胞中miR－206高表达，而在ER阳性细胞中则成相反状况。随后的研究证实 miR－206通过3＇－UTR区调节ERα的表达。将miR－206转染至雌激素依赖性细胞系，对细胞的增长抑制作用呈现出剂量和时间依赖性［12］。同样，miR－221／222也可直接调节ERα的表达，研究还发现ERα和 miR－221／222构成负反馈环路，ERα可通过捕获转录共阻遏物结合到miR－221／222位点对其进行负向调控［13］。与之相似的，miR－22可负向调控ERα，体外实验证实使用miR－22处理ERα阳性乳腺癌细胞可抑制细胞的增殖［14］。 而 Pedro de Souza Rocha Simonini等［14］提 出miR－375在ERα阳性乳腺癌细胞存在高表达，与以往的研究不同，作者首次提出miR－375与ERα构成正反馈环路，并下调RASD1mRNA表达水平，促进乳腺癌细胞生长。基于以上研究，有假设提出，一些miRNA可能促使ER阳性细胞向ER阴性细胞的转变。

3 乳腺癌生物学行为相关的miRNA

肿瘤的侵袭和转移所致的并发症是恶性肿瘤死亡的重要原因，而肿瘤的转移是多步骤、复杂的生物学过程，近年研究发现，miRNA可调节乳腺癌转移的多个关键步骤，如上皮细胞间质转变（EMT）、凋亡及血管生成等过程。EMT是上皮细胞获得迁移能力的重要方式，miR－200家族及miR－205可通过作用于Zeb1及Zeb2而调节EMT过程，miR－205可抑制 MCF－7增殖，并可抑制 MDA－MB－231细胞的侵袭转移能力［15］。多数研究也证实miR－200家族可抑制体外培养细胞的侵袭能力［16］。miR－9的作用靶点为E－钙粘蛋白，E－钙粘蛋白表达缺失常伴随有EMT的发生，进一步研究发现，MYC及MYCN可直接调节miR－9，过表达miR－9，促进细胞增殖，侵袭，并诱导移植瘤的血管生成。Valastyan等［17］研究证实，miR－31在正常乳腺细胞中表达，而在转移性乳腺癌细胞中表达缺失，过表达miR－31可以抑制转移发生的多个步骤，与之相反，在非转移性乳腺癌细胞中使miR－31表达缺失，则可增加细胞转移的能力。随后的研究发现，miR－31可作用其靶点ITGA5、RDX及RhoA，当靶基因表达水平下降时，患者的生存期延长。Zhu等［18］通过对2种乳腺癌模型（MCF－7及 MDA－MB－231）的对比研究，发现与MCF－7乳腺癌模型不同的是，miR－21并不影响 MDA－MB－231乳腺癌模型中原发肿瘤的生长，但能够促进细胞的侵袭以及肺转移，这可能是通过下调其它的肿瘤抑制因子而发挥作用。MUC1是由muc1基因表达的一种高糖基化蛋白。它参与上皮更新及分化，在维持上皮完整性和肿瘤的发生与转移等方面都起到重要的作用。Sachdeva等［19］研究表明miR－145直接调节muc1基因的表达，从而下调β连环蛋白、细胞周期素D和粘钙蛋白，对乳腺癌细胞侵袭及转移起到抑制作用，因此，上调miR－145的表达可以减少乳腺癌细胞的转移。最近，Baffa等［20］通过miRNA微阵列分析43对原发肿瘤及淋巴结转移瘤中异常表达的miRNA，分析显示32个miRNA差异表达，其中包括在转移瘤中明显上调的miR－10b和miR－21以及下调的miR－141、miR－200b、miR－200c和 miR－205等。

综上，miRNA可通过上调或下调基因的表达在肿瘤转移的多个步骤发挥作用，从而成为肿瘤预后评价及抑制肿瘤转移的治疗靶点，通过抑制促转移miRNA或增加抑制转移miRNA的表达，从而在治疗乳腺癌转移方面提供新的策略。

4 乳腺癌多药耐药相关的miRNA

肿瘤的多药耐药（MDR）是目前抗肿瘤治疗中面临的严重问题，MDR的出现使肿瘤不仅对一种抗肿瘤药物产生耐药，而且对其它化学结构及作用机制不同的多种化疗药物产生交叉，广谱的耐药性。乳腺癌多药耐药主要与细胞相关蛋白、雌激素受体及信号通路等改变有关，随着对miRNA研究的深入，发现其在MDR的产生中发挥着重要的作用。

4.1 miRNA调控乳腺癌耐药蛋白（BCRP）

乳腺癌耐药蛋白（BCRP）与乳腺癌的多药耐药关系密切，通过对其进行基因敲除或化学抑制，发现BCRP可以限制肿瘤细胞内的药物堆积，而许多miRNA可以对其进行调控。Li等［21］研究发现乳腺癌耐药细胞株 MCF－7／MX100，转染 miR－328或miR－519c后，肿瘤细胞内米托蒽醌显著增加，进一步研究证实，miR－328和 miR－519c可通过靶向作用于BCRP的3＇－UTR区，从而下调BCRP的表达，而转染miR－520h后，BCRP的表达量并未发生明显改变。而Pelletier等［22］研究证实某些miRNA可以干扰BCRP的3＇－UTR区多态性，从而改变其与3＇－UTR的结合能力，影响乳腺癌耐药性的产生。

4.2 miRNA调控P糖蛋白（P－gp）

P糖蛋白（P－gp）过度表达导致药物外排，是参与乳腺癌多药耐药性产生的经典机制之一。Kovalchuk等［23］研究发现，耐阿霉素的乳腺癌细胞 MCF－7／DOX中miR－451表达水平下降，并且调节miR－451活性的酶Dicer及Argonaute2表达失调，而MDR1及P－gp的表达增加，转染miR－451后，可增强耐药细胞对阿霉素的敏感性，提示miR－451能负向调节P－gp的表达，从而恢复耐药细胞的敏感性。而zhu等［24］研究与之相反，miR－451在肿瘤细胞中的表达具有差异性，miR－451上调P－gp的mRNA及蛋白的表达，从而增加卵巢癌细胞A2780的耐药性。

4.3 miRNA调控多药耐药相关蛋白（MRP）

MRP对乳腺癌多药耐药性也很重要，Liang等［25］研究证实，miR－326可参与调控MRP的表达，从而参与乳腺癌的多药耐药，该研究通过芯片筛查了MRP高表达的乳腺癌耐药细胞株 MCF－7／VP及亲本细胞 MCF－7，发现多种miRNA表达具有差异性，如 miR－326、miR－429、miR－187、miR－7、miR－92、miR197等，其中miR－326显著低表达，进一步研究发现miR－326可作用于 MRP mRNA的3＇－UTR区，转染 miR－326可提高 MCF－7／VP对化疗药物的敏感性。Pogribny等［26］在探讨耐药乳腺癌细胞MCF－7／CDDP及亲本细胞 MCF－7，是否存在相应的miRNA能够针对药物输出泵的潜在靶点，该研究发现miR－7及miR－345能够直接作用于 MRP1基因的3＇－UTR区，将 miR－7及 miR－345转染到耐药细胞株 MCF－7／CDDP，可以使 MRP1含量显著下降，明显提高对顺铂的敏感性。

4.4 miRNA参与乳腺癌多药耐药的其它机制

14－3－3ζ蛋白是14－3－3蛋白家族的一员，可与多种靶蛋白结合，通过与配体蛋白相互作用，对细胞周期，细胞凋亡和多种信号转导发挥调控作用。Anna等［27］研究发现14－3－3ζ在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞 MCF－7（TamR）中表达上调，而miR－451显著下调，并且经他莫昔芬处理后，对14－3－3ζ上调及miR－451下调的作用呈现时间和剂量依赖性，进一步使用荧光素酶报告基因证实miR－451可靶向作用于14－3－3ζ的3＇－UTR区，转染 miR－451后，可通过下调14－3－3ζ、p－MAPK及p－AKT等途径，恢复耐药细胞的敏感性。Zhao等［28］研究发现miR－221和miR－222可直接调节ERα，其在ER阳性乳腺癌细胞中表达时，可降低细胞对他莫昔芬的敏感性。Miller等［29］研究也发现在他莫昔芬耐药的MCF－7细胞系中miR－221和miR－222过表达，并且和HER2＋的乳腺肿瘤的内分泌治疗耐药相关。Erik等［30］发现 miR－519c可以调节 BCRP的表达，miR－21和miR－214可作用于PTEN，从而调节PI3K／AKT信号通路。

展望

miRNA作为促癌或抑癌因子，在肿瘤的发生、发展、转移及耐药等方面发挥着重要的作用，特异性恶性肿瘤相关的miRNA编码基因的发现，为肿瘤治疗提供了新的策略。基于miRNA的诊疗手段，如利用特异性miRNA早期诊断乳腺癌，在已发生转移或产生耐药性的乳腺癌患者中，运用miRNA靶向治疗控制肿瘤发展及逆转耐药性，指导术前分期及手术后化疗方案的制定等，都需要对miRNA的作用靶点及机制进行详细深入的研究。

1 Kim VN，Nam JW.Genomics of microRNA［J］.Trends Genet，2006，22（3）：165－173.

2 Lee Y，Ahn C，Han J，et al.The nuclear RNase III Drosha initates microRNA processing［J］.Nature，2003，425（6956）：415－419.

3 Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets［J］.Cell，2005，120（1）：15－20.

4 Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435（7043）：834－838.

5 Jiang S，Zhang HW，Lu MH，et al.MicroRNA－155Functions as an OncomiR in Breast Cancer by Targeting the Suppressor of Cytokine Signaling 1Gene［J］.Cancer Res，2010，70（8）：3119－3127.

6 Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（7）：2257－2261.

7 Meng F，Henson R，Wehbe－Janek H，et al.MicroRNA－21regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer［J］.Gastroenterology，2007，133（2）：647－658.

8 Abdelrahim M，Samudio I，Smith R，et al.Small inhibitory RNA duplexes for Spl mRNA bl－ock basal and eestrogen induced gene expression and cell cycle progression in MCF－7breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2002，277（32）：28815－28822.

9 Scott GK，Goga A，Bhaumik D，et al.Coordinate suppression of ERBB2and ERBB3by enforced expression of micro－RNA miR－125a or miR－125b［J］.J Biol Chem，2007，282（2）：1479－1486.

10 Greene SB，Gunaratne PH，Hammond SM，et al.A putative role for microRNA－205in mammary epithelial cell progenitors［J］.J Cell Sci，2010，123（Pt 4）：606－618.

11 Cascio S，D Andrea A，Ferla R，et al.miR－20bmodulates VEGF expression by targeting HIF－1alpha and STAT3in MCF－7breast cancer cells［J］.J Cell Physiol，2010，224（1）：242－249.

12 Kondo N，Toyama T，Sugiura H，et al.miR－206Expression is down－regulated in estrogen receptor alpha－positive human breast cancer［J］.Cancer Res，2008，68（13）：5004－5008.

13 Di Leva G，Gasparini P，Piovan C，et al.MicroRNA Cluster 221 222and Estrogen Receptor｛alpha｝Interactions in Breast Cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2010，102（10）：706－721.

14 de Souza Rocha Simonini P，Breiling A，Gupta N，et al.Epigenetically deregulated microRNA－375is involved in a positive feedback loop with estrogen receptor alpha in breast cancer cells［J］.Cancer Res，2010，70（22）：9175－9184.

15 Korpal M，Lee ES，Hu G，et al.The miR－200family inhibits epithelial－mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of E－cadherin transcriptional repressors ZEB1and ZEB2［J］.J Biol Chem，2008，283（22）：14910－14914.

16 Valastyan S，Benaich N，Chang A，et al.Concomitant suppression of three target genes can explain the impact of a microRNA on metastasis［J］.Genes Dev，2009，23（22）：2592－2597.

17 Valastyan S，Reinhardt F，Benaich N，et al.A pleiotropically acting microRNA，miR－31，inhibits breast cancer metastasis［J］.Cell，2009，137（6）：1032－1046.

18 Zhu S，Wu H，Wu F，et al.MicroRNA－21targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis［J］.Cell Res，2008，18（3）：350－359.

19 Sachdeva M，Mo YY.MicroRNA－145Suppresses cell invasion and metastasis by directly targeting mucin 1［J］.Cancer Res，2010，70（1）：378－387.

20 Baffa R，Fassan M，Volinia S，et al.MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets［J］.J Pathol，2009，219（2）：214－221.

21 Li X，Pan YZ，Seigel GM，et al.Breast cancer resistance protein BCRP／ABCG2regulator microRNAs （has－miR－328，－519cand－520h）and their differential expression in stem like ABCG2＋cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2011，81（6）：783－792.

22 Pelletier C，Speed WC，Paranjape T，et al.Rare BRCA1haplotypes inlcuding 3＇－UTR SNPs associated with breast cancer risk［J］.Cell Cycle，2011，10（1）：90－99.

23 Kovalchuk O，Filkowski J，Meservy J，et al.Involvement of microRNA－451in resistance of the MCF－7breast cancer cells to chemotherapeutic drug doxorubicin［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（7）：2152－2159.

24 Zhu H，Wu H，Liu X，et al，Role of microRNA miR－27aand miR－451in the regulation of MDR1／P－glycoprotein expression of hunman cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，76（5）：582－588.

25 Liang Z，Wu H，Xia J，et al.Involvement of miR－326in chemotherapy resistance of breast cancer through modulating expression of multidrug resistance－associated protein 1［J］.Biochem Pharmacol，2010，79（6）：817－824.

26 Pogribny IP，Filkowski JN，Tryndyak VP，et al.Alterations of microRNAs and their targets are associated with acquired resistance of MCF－7breast cancer cells to cisplatin［J］.Int J Cancer，2010，127（8）：1785－1794.

27 Anna B，Benita S.K.Tamoxifen down－regulation of miR－451increases 14－3－3ζand promotes breast cancer cell survival and endocrine resistance［J］.Oncogene，2012，31（1）：39－47.

28 Zhao JJ，Lin J，Yang H，et al.MicroRNA－221／222negatively regulates estrogen receptor alpha and is associated with tamoxifen resistance in breast cancer［J］.J Biol Chem 2008，283（45）：31079－31086.

29 Miller TE，Ghoshal K，Ramaswamy B，et al.MicroRNA－221／222 confers tamoxifen resistance in breast cancer by targeting p27Kip1［J］.J Biol Chem，2008，283（44）：29897－29903.

30 Erik AW.Role of microRNAs in anti－cancer drug resistance［C］.MicroRNAs in Cancer Translational Research，2011，449－483.