微小动脉血管离体标本的直径测量技术

蒋学伟，马克涛，李丽，赵磊，魏丽丽，陈新燕，司军强

（石河子大学医学院生理学教研室／新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002）

我国每年因为心、脑血管相关性疾病死亡的人数约有260万人，平均每小时死亡约300人，成为人类健康的头号杀手。同时，由于环境的污染、饮食习惯的改变和生活节奏的加快，促使心、脑血管相关疾病的发病率和病死率逐年上升。2009年新疆监测县居民死因监测分析，循环系统疾病仍居于首位［1］。

如上所述，心脑血管相关疾病作为危害人类生命和健康的最严重的疾病，其发病关键部位是血管［2］。而微小动脉决定了血管的外周阻力，即血液循环的阻力主要在微小血管节段形成，血压落差达90%［3］。因此，对微小动脉的研究也就凸显其重要性和必要性，应用压力肌动图技术对微小动脉的研究已成为当今生物医学研究的主要方法之一。其优点在于，微小动脉段易于制备且细胞生理功能保存较好，通过对血管的孵育，能够使血管较好的接近于正常生理状态。为研究微小动脉血管舒缩活动的特性以及血管活性物质对血管的作用机制的研究提供了一种新的技术。

1 材料与方法

1．1 标本的制备

实验用Wistar大鼠，购自新疆医科大学实验动物中心（许可证编号SCXK新2003－0001）。体重在200～250g，雌雄不拘，清洁级。将大鼠以戊巴比妥钠（50mg／kg）麻醉后断头处死，迅速打开腹腔，找到胃幽门部，迅速取近幽门10cm内的带系膜的肠管，沿肠系膜血管走行方向扇形剪断，将其放置于已用95%O2、5%CO2混合气体氧饱和的4℃的生理盐溶液（Physiological Saline Soulution，PSS）中。PSS成分是（mmol／L）：NaCl 118．9，KCl 4．69，Mg－SO4·7H2O 1．17，KH2PO41．18，CaCl22．5，NaHCO325，EDTA 0．026，葡萄糖5．5，充入混合气体95%O2、5%CO2调节pH 至7．40。

1．2 动脉血管的分离和套接

将标本固定于带固定胶装有PSS液的培养皿中，在解剖显微镜下用微细组织镊与维纳斯剪小心分离肠系膜血管2级动脉分支，注意区分动静脉，清除血管周围结缔组织，避免损伤内皮。剪取2－3mm无分支的血管段后，放置于PSS液的灌流槽内。将血管一端套接在管口直径约为50μm的玻璃插管（玻璃插管用P－2000拉制仪拉制）上，用10－0眼科尼龙线扎牢，用注射器缓慢冲走血管内的残留血液；再将血管另一端套在另一根玻璃插管上。

1．3 实验装置的连接

将已扎好血管的灌流槽移至压力型小动脉测量仪（Pressure myograph system，DMT，110P，Denmark）的倒置显微镜台上，放大倍数为10倍（目镜）×10倍（物镜）。将P1端与装有PSS液的外液瓶连接，P2端与废液瓶连接，然后用装有PSS液的5mL注射器缓慢将P1端与外液瓶和P2端与废液瓶间的气体排掉，以保证实验过程中血管段内无残留气体，操作期间注意手法要轻，以免损坏压力感受器。将浴槽中恒速通以95%O2、5%CO2混合气体，温度维持在37℃。

1．4 动脉血管段活性的平衡

初始平衡阶段保持液体流入P1压力为20mm－Hg、P2压力5mmHg，持续时间为3min，以冲走血管内的残留物；之后液体流入P1、流出P2端均调至10mmHg，以10mmHg为一个梯级，使管腔内压力逐渐增加到60mmHg，每个梯级停留5min。管腔内压力增至60mmHg后，血管段在PSS液中再稳定1h，平衡期间每20min更换浴槽内液体一次。

1．5 血管收缩和舒张功能检测

血管段在PSS液中平衡1h后进行标准化［4］。孵育30min，先用血管活性剂去甲肾上腺素（10－8mol／L，norepinephrine，NE）激发动脉段收缩，收缩达到最大或平稳后，用乙酰胆碱 （10－5mol／L，acetylcholine，ACh）舒张，之后用PSS液洗涤四次，准备实验。在标准化中，以 K－PSS液（potassium physiological saline solution，125mmol／L KCl）检测动脉段收缩性，两次收缩幅度相差小于10%，用ACh舒张时，舒张率大于80%认为内皮完整，可用于实验。

K－PSS溶 液 成 分 是 （mmol／L）：KCl 123．70，MgSO4·7H2O 1．17，KH2PO41．18，CaCl22．5，NaHCO325，EDTA 0．026，葡萄糖5．5，充入混合气体95%O2、5%CO2调节pH 至7．40。

1．6 记录药物对微小动脉段离体标本作用前后血管直径的变化

血管检测符合试验标准后，开始实验，用Myoview软件（丹麦DMT公司）控制血管内压力稳定在60mmHg，温度维持在37℃。打开负压吸引器，将水浴槽内的PSS液控制在5mL，依次用微量移液器（德国Eppendof公司）向浴槽中（5mL）以累积法依次加入血管用药，在血管反应达到最大值或稳定状态加入高一级浓度，分别观察该药物对血管直径的作用，并记录血管段在PSS中的血管直径稳定值（Dp）及实验用药后，引起血管直径变化后的稳定值（Dx）。

血管直径变化按下式计算：

直径变化（μm）＝Dp－Dx。

1．7 实验试药

苯肾上腺素 （phenylephrine，PE）、乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）、均为美国Sigma公司产品；去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、氯化钾（KCl）及其余试剂均为国产分析纯。

1．8 统计学方法

应用SPSS 17．0分析软件完成统计学分析，实验结果以¯X±S表示，组间比较采用t检验，以P＜0．05为有统计学差异。

2 结果与分析

实验用离体微小动脉血管段标本直径为361．945±11．145μm（n＝6），血管经过标化后，开始实验。用微量移液器（德国Eppendof公司）依次向浴槽中（5mL）以累积法依次加入不同浓度的PE，在血管收缩达到收缩稳定后加入高一级浓度，其最终浓度依次为0．1、0．3、1、3、10、30、100μmol／L（图2），分别观察PE对血管直径的作用，并测量所需数据。血管直径变化按下式计算：直径变化（μm）＝DP－DPE。式中：DP为血管段在PSS中的血管直径稳定值，DPE为PE引起血管收缩后的直径稳定值。PE各浓度（0．1、0．3、1、3、10、30、100μmol／L）引起血管直径变化值分别为：3．07±2．03；17．86±7．84；41．60±11．93；130．45±21．39；186．91±15．82；196．61±13．73；197．58±12．39（单位）（n＝6）。图3显示，PE引起血管直径收缩的幅度经标化后，可见当PE浓度≤0．3μmol／L时，血管直径基本没有变化（P＞0．05）；当PE浓度为1μmol／L时，血管收缩程度明显（P＜0．05）；当PE浓度＞3μmol／L，血管收缩程度进一步增加（P＜0．01）。PE对血管直径的收缩作用呈浓度依赖性。

3 讨论

微动脉是小动脉的分支，和小动脉共同决定了血管的外周阻力。微小动脉血管由内皮细胞和平滑肌细胞组成，其中内皮细胞间、平滑肌细胞间，内皮细胞与平滑肌细胞间都存在着大量的由缝隙连接介导的电和化学信号交流。这就使得血管壁能够在纵向上和横向上保持电活动、机械活动的同步，使得整个血管成为统一的功能单位，对兴奋或非兴奋作出统一的反应，维持了血管生理功能的稳定和一致［5－7］。病理情况下，细胞间缝隙连接的机构和功能受到损伤，使血管细胞间的同步收缩发生障碍［8］。血管相关性疾病（如心、脑血管病）的发生、发展与阻力血管功能改变密切相关［9－10］。血管紧张度反应是微小动脉对血管内压力改变而发生自主性收缩的一种内在特性，对于维持微小动脉功能具有重要的作用。当压力在一定范围内波动时，小动脉可依据这种特性，自动调节压力和血管管径之间的关系，进而保证器官血流量的稳定［11］。所以，在神经递质和药物等血管活性物质的研究中，一般选用微小动脉作为研究对象。对微小动脉的研究，应用压力肌动图技术能够更好地研究其舒缩活动的特性以及血管活性物质对血管的作用机制。

压力肌动图技术具有以下优点：1）标本易于制备，且对血管损伤较小，人工去除肠系膜动脉周围组织暴露出血管，即可进行实验，不必做任何有损血管活性的处理。2）能够直观准确的记录微小动脉血管直径的变化幅值及血管壁的厚度。3）实验是在血管内等压情况下进行，研究神经递质和药物直接作用于血管，能够更好的模拟动物体内环境。实验结果可见，应用不同浓度血管收缩剂PE作用血管，能够很直观、清楚地记录血管直径的变化，能直观的观察药物对微小动脉舒缩活动的影响。总之，通过压力肌动图技术，研究血管壁细胞间缝隙连接的作用，以及神经递质和药物等血管活性物质对微小动脉舒缩活动的影响，能够进一步拓宽对心脑血管疾病研究。

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