绢蒿水煎剂对正常小鼠免疫调节作用的研究

王荣，剡根强，王静梅，段海丰，刑伟元，万鹏

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

绢蒿（（Serphidium（Bess）Poljak）属菊科蒿属植物，是新疆分布较广，牛羊喜食的一种蒿属牧草［1－2］。绢蒿和药用植物青蒿同属于蒿属植物，已有的研究表明，绢蒿与青蒿均含有丰富的萜类化合物及芳香族化合物。从青蒿植物提取的青蒿素不仅是抗虐特效药，同时还具有免疫调节作用。青蒿素能有效诱导淋巴细胞增殖转化，促进干扰素，白细胞介素的释放，调节巨噬细胞的吞噬功能等作用［3－5］。

目前，但有关绢蒿牧草是否具有青蒿相似的免疫调节作用未见研究报道。为此，本试验借鉴青蒿的免疫学研究方法，制备绢蒿水煎剂给小鼠灌服，通过检测小鼠T、B淋巴细胞的转化、T淋巴细胞的数量、T淋巴细胞亚群、IFN－γ、IL－2及巨噬细胞吞噬活性等免疫学指标，研究确定绢蒿的免疫生物学活性，旨在为进一步开发具有营养与保健双重作用的植物饲用添加剂提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验动物

昆明小白鼠，6周龄，体重（20．0±2．0）g，石河子大学实验动物中心提供。

1．1．2 试验药物

绢蒿牧草，采自石河子南山草场5－7月绢蒿茎叶，阴干待用。

1．1．3 主要仪器与试剂

灌胃针；Power Wave XS2 连续波长酶标仪（BioTek）；CD4＋T ELISA 试剂盒、CD8＋T ELISA试剂盒、IFN－γELISA 试剂盒、IL－2ELISA 试剂盒均购于上海蓝基生物科技有限公司。

1．2 方法

1．2．1 水煎剂的制备，试验动物分组及给药方式

取绢蒿干草，经切片机粗粉，粉碎机细粉后，于不锈钢锅中煎煮［6］。合并的煎液置干燥箱80℃温度下浓缩成每毫升相当于原绢蒿生药约1g的药液。用时以蒸馏水稀释为所需浓度，置4℃冰箱保存备用。

选取90只小鼠，称重后随机分成3组，即正常对照组（蒸馏水）；低浓度组（800mg／kg）和高浓度组（2000mg／kg），均采用灌胃给药，0．4 （mL／次）／只，连用10d。

1．2．2 绢蒿水煎剂对小鼠T、B淋巴细胞转化能力的测定

T淋巴细胞转化试验［7］：采用ConA作为刺激剂。制备脾淋巴细胞悬液，加入到96孔培养板，100 μL／孔，然后加入使每孔最终浓度为5μg／mL的ConA液，100μL／孔，每个样设3个重复，且重复做4块细胞培养板。将板置培养箱（37℃，5%CO2）分别培养24、48、72和96h。培养过程中隔3～8h震荡培养板1次。MTT比色法检测细胞增殖结果，酶标仪测OD值，测定波长570nm。

B淋巴细胞转化试验：采用LPS作为刺激剂。试验方法同T淋巴细胞转化试验，其中LPS液最终浓度为10μg／mL。

1．2．3 绢蒿水煎剂对小鼠T淋巴细胞数量（ANAE）的测定

采集小鼠抗凝血，按酸性α－醋酸萘酯酶（ANAE）染色法染色［8］。

1．2．4 绢蒿水煎剂对小鼠外周血T细胞亚群的测定

小鼠采血分离血清。CD4＋、CD8＋T数量测定按ELISA试剂盒说明检测，其中被检样品、空白对照和标准曲线做各重复3孔。

1．2．5 绢蒿水煎剂对小鼠巨噬细胞吞噬功能的测定

灌胃第8天，小鼠腹腔注射6%的淀粉溶液1．0 mL／只。中性红法检测巨噬细胞吞噬功能，酶标仪于520nm波长测吸光度，以吸光度值大小表示巨噬细胞摄取中性红的能力强弱，结果以酶标仪A值表示［9］。

1．2．6 绢蒿水煎剂对小鼠IFN－γ、IL－2的测定

小鼠采血分离血清。IFN－γ和IL－2的测定按ELISA试剂盒说明检测，其中被检样品、空白对照和标准曲线做各重复3孔。

1．3 统计学处理

所有数据经SPSS统计学处理后数据以均数±标准差（¯x±S）表示。组间差异采用t检验。P＜0．05为差异显著，P＜0．01为差异极显著，有统计学意义。

2 结果与分析

2．1 绢蒿水煎剂对T、B淋巴细胞转化能力的影响

如图1、2所示，从48h开始，三组试验组T、B淋巴细胞增殖均明显；72h时绢蒿水煎剂高浓度组和低浓度组的T、B淋巴细胞增殖程度均达到最大；96h时绢蒿水煎剂高浓度组和低浓度组的T、B淋巴细胞增殖程度均无明显变化。

如表1所示，绢蒿水煎剂高浓度组的T淋巴细胞增殖程度明显高于对照组（P＜0．01）；绢蒿水煎剂低浓度组的T淋巴细胞增殖程度高于对照组（P＜0．05）；绢蒿水煎剂高浓度组的T淋巴细胞增殖程度接近低浓度组（P＞0．05）。绢蒿水煎剂高浓度组的B淋巴细胞增殖程度高于对照组（P＜0．05）。

2．2 绢蒿水煎剂对小鼠免疫指标的影响

2．2．1 绢蒿水煎剂对T淋巴细胞数量的影响

如表1所示，绢蒿水煎剂高低浓度组的小鼠T淋巴细胞ANAE阳性率均显著高于对照组（P＜0．01）；绢蒿水煎剂高低浓度组间的T淋巴细胞ANAE阳性率差异不显著（P＞0．05）。

2．2．2 绢蒿水煎剂对T淋巴细胞亚群数量的影响

如表1所示，绢蒿水煎剂低浓度组的CD4＋T，CD8＋T含量均高于对照组（P＜0．05）；绢蒿水煎剂高浓度组的CD4＋T，CD8＋T含量均比对照组低，差异不显著（P＞0．05）

2．2．3 绢蒿水煎剂对巨噬细胞吞噬功能的影响

绢蒿水煎剂低浓度组巨噬细胞吞噬能力稍高于对照组，差异不显著（P＞0．05）；绢蒿水煎剂高浓度组的巨噬细胞吞噬能力略低于对照组，差异不显著（P＞0．05）。

2．2．4 绢蒿水煎剂对小鼠IFN－γ、IL－2含量的影响

绢蒿水煎剂低浓度组IFN－γ含量高于对照组（P＜0．05）；高浓度组IFN－γ含量明显低于对照组（P＜0．01）；绢蒿水煎剂低浓度组IL－2含量明显高于对照组（P＜0．01）；绢蒿水煎剂高浓度组IL－2含量略低于对照组，差异不显著（P＞0．05）。

3 讨论

绢蒿水煎剂对小鼠T、B淋巴细胞转化能力，T淋巴细胞亚群数量，IFN－γ、IL－2含量的影响与青蒿具有相似性。其原因：青蒿素是从菊科植物蒿属中提取的倍半萜内酯，绢蒿属作为蒿属中的一个组或亚属一直被看作是一个大类群，与青蒿的研究历史紧密相关；青蒿植物含有丰富的萜类化合物，芳香族化合物，醇、醛、酮类化合物，长链脂肪烃［10－11］等成分，与绢蒿成分相似；绢蒿水煎剂对小鼠T，B淋巴细胞转化能力，巨噬细胞吞噬功能的影响与青蒿不完全一致［12－13］，除检测方法不同外，主要原因可能是所用药物材料不同。中药青蒿通常分离提取有效成分进行试验，而本试验中采用水煎法保留了牧草绢蒿的全草成分。

T淋巴细胞分化为TDT H细胞，并产生细胞因子，从而发挥细胞免疫的作用；B淋巴细胞主要作用是对抗原的识别、活化、增殖，分化为浆细胞并分泌抗体［14］，根据淋巴细胞的转化情况，可判断机体的细胞和体液免疫水平。本试验中绢蒿水煎剂对T、B细胞的转化能力具有上调作用，因此绢蒿制剂可能具有提高机体细胞免疫，体液免疫作用。巨噬细胞是主要的炎性反应调节细胞和抗原提呈细胞，在炎性反应过程中分泌不同的细胞因子（IL－1、IL－6、IL－10、TNF）和趋化因子等，间接或直接地参与各种炎性反应过程［15］。本试验中高浓度绢蒿水煎剂对小鼠的巨噬细胞具有下调作用，因此绢蒿制剂可能具有缓解炎性反应作用，这为绢蒿制剂在超敏反应，免疫应激中的应用提供了试验依据。

绢蒿水煎剂低浓度组对T淋巴细胞亚群数量，巨噬细胞吞噬功能，IFN－γ、IL－2含量具有上调作用，高浓度组具有下调作用，这与多数免疫调节剂的特性一致，表明绢蒿对机体免疫功能的影响具有剂量依赖性［16］。提示，在今后的试验和临床研究中考虑绢蒿剂量的选择。

［1］林有润．中国植物志（第七十六卷第二分册）［M］．北京：科学出版社，1991：259－290．

［2］于磊，鲁为华，代焕喜，等．新疆兵团农十四师一牧场天然草地资源及其利用研究［J］．石河子大学学报：自然科学版，2007，25（1）：56－59．

［3］Xu F X．Sclerotesta Morphology and its Systematic Implications in Magnoliaceous Seeds［J］．Botanical Journa1 of the Linnean Societv，2003，142（4）：407－424．

［4］舒贝，马行一．青蒿素及其衍生物的免疫调节作用［J］．中国中西医结合肾病杂志，2005，6（3）：176－178．

［5］ Wenisch C，Parschalk B，Zedwitz－Liebenstein K，et al．The effect of artemisin on granulocyte assessed by flow cytometry［J］．Antimicrob Chemocher，1997，39（1）：101．

［6］陈奇．中药药理研究方法学［M］．2版．北京：人民卫生出版社，1993：69．

［7］罗燕．中药复方总多糖对小鼠免疫功能的影响及小鼠相关差异基因的筛选［D］．石河子：石河子大学，2005．

［8］王凯，杨丽梅，霍星华，等．霉玉米对小鼠体重和外周血淋巴细胞数量的影响［J］．动物医学进展，2006，27（3）：81－84．

［9］Abul K，A bbas，Andrew H．Lichtman．Cellular and Molecular lmmunology［M］．Fifth Edition．北京：北京大学医学出版社，2004：16－104．

［10］滑艳，何荔，汪汉卿．白茎绢蒿化学成分的研究［J］．天然产物研究与开发，2003，15（3）：219－221．

［11］肖黎辉，冯学兵．青蒿素类药物与自身免疫性疾病［J］．辽宁中医药大学学报，2011（1）：130－133．

［12］Efferth T，Sauerbrey A，Olbrich A，et al．Molecular modes of action of artesunate in tumor cell lines［J］．Mol Pharmacol，2003，64（2）：382－3941．

［13］Aldieri E，Atragene D，Bergandi L，et al．Artemisinin inhibits inducible nitricoxide synthase and nuclear factor NF－κB activation［J］．FEBS Lett，2003，552（2／3）：141－144．

［14］邵永斌．中药G－免疫增强剂复方和单味中药多糖的免疫增强作用研究［D］．石河子：石河子大学，2005．

［15］李丹，任亚娜，范华骅，等．巨噬细胞的分类及其调节性功能的差异［J］．生命科学，2011，23（3）：250－253．

［16］杨巧丽，顾政一，黄华，等．金蒿抗流感滴丸对小鼠TNF－α、IL－2和IFN－γ等细胞因子的影响［J］．石河子大学学报：自然科学版，2012，30（1）：57－59．