哺乳动物细胞转染技术概述

张荣华 王冰

哈药集团技术中心 黑龙江哈尔滨 150025

为了达到基因治疗的目的，目前已经建立许多基因转导的方法，这些方法为基因治疗的最新进展做出了很大的贡献。哺乳动物细胞转染技术就是将构建出来的目的基因通过载体导入不同的哺乳动物细胞内，进行基因功能研究的方法，转染大致可分为物理转导、化学转导和病毒转导三种途径。

物理转导

是利用物理力量导致细胞膜的瞬间缺损，从而使DNA 质粒进入细胞内的方法，如电穿孔法、基因枪法、注射法等。

注射法:直接将DNA 质粒注射入组织细胞中以达到基因转导的目的。注射法还可以将裸露的DNA 质粒注射入肌肉、肝脏、皮肤等组织，有研究报道将DNA 质粒逆行注入到肝静脉和胆管后能够高效表达［1］。

基因枪法:是把压缩气体(氮或氦)转换成气体时所产生的冲击波作为动力，把DNA 质粒直接射入组织、细胞和细胞器中，基因枪导入的基因被证明可在各种类型的细胞中得到瞬时高效表达。

电穿孔法:通过短暂高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，将DNA 质粒导入细胞内。电穿孔法是一种既可以用于体外也可以用于体内的基因转移方法。目前体内用电穿孔法导入基因主要用于皮肤和肌肉组织。Molnar 等于2004 年［2］，采用电穿孔法将外源基因导入免疫缺陷鼠体内，此基因稳定表达超过1 年时间。王强等用电穿孔法将pGFP 质粒导入K562 白血病细胞中［3］，获得90%以上的表达绿色荧光的细胞，稳定表达半年以上。钱锋等通过电穿孔法使非贴壁细胞和难转染细胞得到转染［4］。

化学转导

化学转导主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物转导。阳离子脂质体或阳离子聚合物通过细胞吞噬或吞饮作用将目的基因携带进入靶细胞中。

阳离子脂质体转导:1987 年，自从Felgner 等首次发现脂质体可以转移基因后［5］，大量被改良的阳离子脂质体用于转移基因。在美国和欧洲，阳离子脂质体转导外源的基因疗法交付目前占正在进行的基因治疗临床试验的9% ～12%［6］。刘志国等采用Lipofectine 转染方法达到了外源基因在CHO 细胞中高效瞬时表达的目的［7］。

阳离子聚合物转导的基因转移:第一个被用于基因转移的阳离子聚合物是多聚赖氨酸，此后越来越多的分枝状或线状的阳离子聚合物被用于外源基因转导。其中主要包括人工合成的如聚甲基丙烯酸(PMA)、聚乙烯亚胺(PEI)等［8］。孙祥明等将PEI 携带DNA 质粒导入密度为1 ×107个/ml 细胞中［9］，转染8 天后，在10．7L 培养液中收集到227mg 的EPO 蛋白。

病毒介导

将目的基因整合到特定的病毒中，通过病毒感染细胞，使目的基因转导入细胞中。能够进行转导的病毒包括逆转录病毒、腺病毒、痘病毒和杆状病毒。总的来说，病毒体系时间长代价高也比较复杂，操作不当还可能有潜在的危险。

结语

综上所述，电穿孔法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法和病毒法因转染效率高，成为近年来应用较多的哺乳动物细胞转染方法。但每种方法也有其自身的局限性:电穿孔法细胞死率高;脂质体法在体内能够引起免疫反应;阳离子聚合物法有某些细胞毒性;病毒法则需考虑转染后的安全因素。只有选择合适的方法，才有利于外源基因在宿主细胞中的高效表达。

1 Zhang G，Vargo D，Budker V，et al．Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers［J］．Hum Gene Ther，1997(8):1763．

2 Molnar MJ，Gilbert R，Lu Y，et al．Factors influencing the efficacy，longevity，and safety of electroporation assisted plasmid based gene transfer into mouse muscles［J］．Mol Ther，2004(10):447．

3 王强，刘红云，沈关心．绿色荧光蛋白白血病鸡胚模型的构建［J］． 华中医学杂志，2006(1):67．

4 钱锋，肖成组．电击缓冲液对哺乳动物细胞电穿孔效率的影响［J］．军事医学科学院院刊，1999，23(2):101-103．

5 Felgner PL，Gadek TR，Holm M，et al．Lipofection:a highly effi cient，lipid mediated DNA transfection procedure［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1987(84):7413．

6 Alexander V Kabanov． Taking polycation gene delivery systems from in vitro to in vivo［J］．Today，1999，2(9):365-372．

7 刘志国，屈伸．DNA 高效转染CHO 细胞的研究． 武汉工业学院学报，2002(1):4-6．

8 Boussif O，Lezoualch F，Zanta MA，et al．A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:polyethylenimine［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1995(92):7297．

9 Xiangming Sun，Hui Ching Hia，Peen Ern Goh，Miranda G．S．Yap． Highdensity transient gene expression in suspension-adapted 293 EBNA1 cells［J］．Biotechnology and Bioengineering，2008，1(99):108-116．