鸭坦布苏病毒病诊断方法概述

陈桂英

（青海湟中县总寨镇畜牧兽医工作站，青海湟中811602）

自2010年春季开始，我国福建、浙江、上海、山东等主要鸭养殖密集区由南到北暴发了一种以种鸭、蛋鸭产蛋急剧下降为主要临床特点，以出血性卵巢炎为主要病变特点的新发、急性、烈性传染病，给我国养鸭业造成了巨大经济损失［1－3］。该病同时具有发病急、传播速度快、发病率高等主要流行特点，病鸭主要表现为高热，食欲下降甚至废绝，产蛋数量迅速下降直至停产，发病率几乎为100%，病死率约为5%～15%［4－6］。为有效预防和控制该新发传染病，国内外学者迅速开展针对该病的病原学、诊断技术、疫苗等方面的相关研究工作，相继提出鸭出血性卵巢炎、鸭产蛋下降综合征、鸭传染性产蛋减少症、鸭病毒性脑炎等名称［7－10］。随着对该病病原学研究的不断深入，该病被统一确诊为由一种新型的黄病毒——鸭坦布苏病毒 （Duck tembusu virus，DTMUV）引起，故将该病统一命名为鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu virus disease，DTMUVD）［11－14］。对于DTMUVD的诊断，根据临床症状、病理变化和流行病学即可做出初步诊断，但要确诊该病毒需进行病毒分离与鉴定及分子生物学检测等实验室诊断。本文综述了DTMUVD诊断方法的最新研究进展，以期为临床DTMUV感染进行早期快速、准确的诊断提供参考，为制定该病的合理综合防控策略提供依据。

1 临床诊断

1.1 临床症状

感染鸭主要表现为采食量突然迅速下降，随之产蛋率大幅度下降，由高峰期的90%降至10%左右，群内发病率达100%，病死率为5%～15%。鸭发病后体温升高，排绿色稀粪，在感染的后期，出现腿瘫、行走不稳、转圈等神经症状。该病病程约为1个多月，发病后15d～20d采食量开始逐渐恢复，绿色粪便逐渐减少，体温开始降低，产蛋率逐渐回升，有的可恢复到发病前的水平［1－3，5，14］。

1.2 病理变化

病理剖检发现该病的主要病变部位在卵巢，表现为卵巢岀血、变性、萎缩和破裂；卵泡膜充血和出血；卵泡严重出血、萎缩和坏死。多数病鸭肝脏淤血、肿大、坏死；脾脏肿大、呈大理石样，有的因极度肿大而破 裂；心 脏 的 心 肌 外 壁、内 膜 岀 血［1－3，5，10，14］。具有神经症状的发病鸭可见脑膜岀血，脑组织水肿［15］。

1.3 流行病学

鸭坦布苏病毒病发病突然，传播快速，可感染除番鸭外的所用品种产蛋鸭，以及产蛋鸡和产蛋鹅［16－18］。将DTMUV 分离株注 射给蛋鸭、雏鸭、雏鸡、雏鹅能复制出DTMUVD的典型临床症状和病理变化，并可回收到DTMUV。DTMUV本质属蚊虫传媒病毒，提示该病毒可能会经蚊子等传播。从发病鸭场内死亡的麻雀体内可检出本病毒，提示该病毒可经鸟类传播［14］。病鸭的卵泡膜中DTMUV检出率最高，提示该病毒可垂直传播。赵冬敏等［19］证实该病毒可以通过鹅胚传到下一代，即该病毒在种鹅中存在垂直传播。从泄殖腔拭子可分离到病毒，表明该病毒可经粪便排毒，提示经污染的环境、饲料、饮水、器具、运输工具等均可传播病毒［14］。

2 病毒的分离与鉴定

病毒分离鉴定是DTMUV经典、准确、可靠的诊断方法，发病鸭的卵泡膜、肝脏、脾脏等病变组织均可分离到病毒。万春和等［20］从产蛋骤降的病死种鸭中无菌采集卵巢经尿囊腔途径接种10日龄健康番鸭胚，成功分离到一株DTMUV。李玉峰等［10］采集产蛋下降的樱桃谷种鸭的脾脏、卵泡膜等组织病料，以及出现神经症状雏鸭的脑膜、脑组织等组织病料分别作为接种样品，成功分离到了2株DTMUV，分别命名为BZ株和LC株。黄欣梅等［18］采集发病鹅的肝脏、脾脏等病变组织，经尿囊腔途径接种12日龄鸭胚，成功分离1株DTMUV。陈仕龙等［17］从临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、卵泡膜出血的发病蛋鸡的卵巢、输卵管、肝、脾等组织中分离到3株DTMUV。

3 RT－PCR方法

RT－PCR技术具有快速、特异、简便等优点，是实验室常用的分子生物学诊断技术，为MDTUVD刚刚暴发时的确诊做出了较大的贡献，也是目前MDTUV准确、简单、快速诊断的主要方法。李玉峰等［10］对分离的病毒用新城疫病毒、流感病毒等不同禽病的特异性引物分别进行PCR或RT－PCR检测，均未扩增出特异条带，但用随机引物进行RT－PCR扩增出基因片段，将其利用GenBank进行Blast同源性比较，确定分离病毒为 MDTUV。曹贞贞等［3］分离的病毒经鸭瘟病毒、水禽细小病毒、鸭呼肠病毒、鸭甲型肝炎病毒、鸭星状病毒、鸭圆环病毒、鸭冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒PCR检测均为阴性，基于黄病毒NS1序列合成特异性引物检测15株病毒分离物和19份临床样品，结果显示，15个病毒分离物中12个为阳性，19份临床样品中16份为阳性，总阳性率为82.4%。张帅等［21］在对DTMUV序列比对分析的基础上，设计了一对特异性引物，优化PCR反应条件，建立了检测DTMUV的一步法RT－PCR方法。该方法具有特异、快速、敏感、准确等特点，可以检出1.82个TCID50的病毒核酸；应用该方法对2010年－2011年收集的106份产蛋下降鸭群临床病料进行了检测，阳性率为46.2%，表明DTMUV在我国产蛋鸭群中具有较高的感染率。王劭等［22］建立了检测禽黄病毒的RT－PCR检测方法，该方法能从鸡黄病毒、鸭黄病毒中扩增出一条约708bp的特异性片段，而不能从鸡传染性支气管炎病毒、番鸭呼肠病毒、禽呼肠病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡减蛋综合征病毒扩增出目的片段，该方法最低可检出10－3TCID50／0.1mL的病毒核酸，显示出了良好的特异性、敏感性和准确性，可以作为禽黄病毒的临床快速诊断和分子流行病学调查，为研究和控制DTMU在我国的流行具有重要意义。

4 套式RT－PCR方法

唐熠等［23］根据GenBank中Bagaza株DTMUV的NS3基因保守序列设计了3条引物，建立了一种适用于DTMUV快速检测的半套式RT－PCR方法。该方法对2个分离株DTMUV均能扩增出277bp的特异性条带，而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性；该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝／μL，第2次扩增的敏感性为1×102拷贝／μL，第2次扩增的敏感性比第1次高103倍；该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。该半套式RT－PCR检测方法具有操作简单、快速、特异性好、敏感性高的优点，可从病料组织和鸭胚尿囊液中检测到MDTUV，可用于DTMUV感染的临床诊断和流行病学调查，且样品长期冻存后不影响检测结果，将有广阔的应用前景。黄欣梅等［24］根据GenBank发表的鹅黄病毒JS804株全基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计了2对特异性引物，建立了禽黄病毒套式RT－PCR检测方法。该套式RT－PCR方法具有特异性强、敏感性高的特点，最低病毒检测量为101.89TCID50／0.1mL，比普通 RT－PCR方法敏感性高1 000倍；应用该方法对江苏地区疑似禽黄病毒病的70份鹅病料、4份鸭病料、12份鸡病料进行检测，总阳性率为58.14%，而用普通RT－PCR方法检测的阳性率仅为17.44%。该套式RT－PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点，可用于禽黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查，将为该病的防控发挥重要作用。

5 荧光定量RT－PCR方法

实时荧光定量PCR技术融合了常规PCR技术的高灵敏性和光谱技术的高精确定量的特点，具有定量准确、灵敏度高、特异性强、速度快、自动化等优点，是当前动物疫病检测技术中简单、快速、敏感、特异的定量检测技术。Yun T等［25］在DTMUV高度保守的3′端非编码区设计一对特异性引物，建立定量检测DTMUV的实时荧光定量RT－PCR方法，该方法检测的灵敏度可达10拷贝／μL；该方法检测常见禽病毒均为阴性；对标准品RNA检测的线性范围为2.0×101～2.0×108拷贝／μL；包括核酸的提取过程在内，2h内即可完成检测。该方法具有很高的特异性、敏感性和重复性，能在较广的范围内准确定量，实现了DTMUV的快速、灵敏、特异、定量检测，为DTMUV感染的临床诊断提供了一个良好的常规诊断方法。Yan L等［26］根据GenBank中登录的DTMUV基因组序列，在E基因序列区内设计了用于TaqMan荧光定量RT－PCR的一对特异性引物及TaqMan探针，以分离株DTMUV为模板，在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件，建立了检测DTMUV的荧光定量RTPCR方法。该方法的灵敏度比常规RT－PCR方法高100倍，检测常见禽病病毒均为阴性，具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强、重复性好、准确、耗时短的特点，为DTMUV的快速诊断、流行病学调查与监测提供了有效的技术手段。李庆阳等［27］根据鸭坦布苏病毒（DTMUV）BYD－1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT－PCR方法。该方法检测DTMUV呈阳性，而检测3株非鸭坦布苏病毒均为阴性，最低检测限为1.0×101拷贝／μL，利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的脾脏和肝脏组织进行检测，阳性率均为100%，而用普通RT－PCR方法检测的阳性检测率为85%（17／20）和75%（15／20）。该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点，可用于DTMUV早期感染的快速诊断和流行病学调查。

6 RT－LAMP方法

环 介 导 等 温 扩 增 （loop－mediated isothermal amplification，LAMP）技术一种新型恒温核酸扩增技术，因其具有无需PCR仪等特殊仪器设备、操作简便、反应迅速、肉眼判读、成本低廉、特异性强、灵敏度高等优点，特别适合在现场和基层部门应用。Wang Y等［28］参照GenBank中最新的 MDTUV及其他黄病毒基因组序列设计针对MDTUV E基因保守区的6对引物，建立了可视化检测MDTUV的RT－LAMP方法。该方法在63℃水浴的条件下，50 min即可完成扩增；检测MDTUV分离毒株的敏感性达2拷贝／μL，而常规RT－PCR方法仅为190拷贝／μL；检测常见禽病毒均为阴性；检测快速、灵敏、特异、无需特殊的仪器，为基层实验室MDTUV的检测提供了简单、快速的诊断方法。Tang Y等［29］建立的MDTUV的RT－LAMP检测方法的检测灵敏度达45拷贝／μL；检测常见10种禽病毒均为阴性；在对样品的检测中与常规RT－PCR方法检测结果一致。Yan L等［30］对检测 DTMUV RT－LAMP和RT－PCR方法进行了比较分析，得出2种检测方法检测的敏感性均为0.01ELD50；检测常见鸭病毒均为阴性；RT－PCR方法的重复性好于RT－LAMP方法；2种方法在同时对96份临产样品的检测中，只有3份检测结果不同，符合率达96.9%（93／96）。RT－LAMP方法敏感、特异、操作简单、经济适用，可用于DTMUV的快速诊断，可为基层实验室或养殖场开展DTMUV的诊断与流行病学调查提供一种简单、快速、准确的分子生物学诊断方法。李兆龙等［31］根据禽新型黄病毒E蛋白基因序列，在保守区设计了一套针对禽新型黄病毒基因8个区域的6条特异性引物，并对反应条件进行优化，建立了适合基层应用的DTMUV RT－LAMP快速检测方法。该RT－LAMP方法整个扩增反应只需在常规水浴锅中45min内即可完成；对新型鸭呼肠病毒、鹅细小病毒、番鸭呼肠病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒均无扩增反应；对DTMUV RNA的最小检测限度为1pg，灵敏度是一步法RT－PCR方法的100倍。该RT－LAMP方法简便、快速、灵敏、特异，适合在基层兽医站和养殖场进行DTMUV的快速检测，对指导当前DTMUV的防控具有重要意义。

7 核酸探针

核酸探针技术不受抗原抗体反应的限制，操作简单，结果易于判定，具有准确、快速、重复性好的优点，也是目前常用的分子生物学诊断技术。高绪慧等［32］根据GenBank中Bagaza株 MDTUV基因组序列设计一对特异性引物，扩增NS3基因406bp的特异性片段，将纯化的PCR产物用对人体无伤害的地高辛进行探针标记，建立了地高辛标记探针检测MDTUV的方法。该探针仅与MDTUV的核酸发生特异性杂交，而与鸭瘟病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的核酸不发生杂交；该探针对MDTUV的RNA最低检出限量为100μg／L；采用该方法和RT－PCR方法对20份MDTUV核酸进行检测，2种检测方法检测结果一致，符合率达100%；该方法对疑似MDTUV感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测，以卵泡膜的检出率最高。该方法显示出了较强的特异性和较高的敏感性，同时不需要特殊设备，一次可以检测多个样品，适合在基层推广应用，为MDTUV感染的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。

8 血清学检测方法

姬希 文 等［33］利 用 纯化的 DTMUV 奉 贤 株（FX2010）免疫Balb／c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得3株能够稳定分泌杭DTMUV的杂交瘤细胞，间接ELISA和IFA结果显示3株细胞获得的单杭均可以与DTMUV发生特异性反应，其中1株为针对DTMUV E蛋白中和表位的单杭。该3株单抗的获得为进一步研发DTMUV血清学诊断方法奠定了坚实的基础。姬希文等［34］利用纯化的DTMUV奉贤株（FX2010）作为包被抗原，对检测条件进行优化，建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。该方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒、呼肠病毒、禽白血病病毒的阳性血清检测均为阴性；对DTMUV阳性血清检测的灵敏度为1∶6 400；批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%；用该方法和琼脂扩散试验（AGP）同时对140份疑似DTMUV血清样品进行检测，该方法检测出阳性108份，而AGP检测出阳性32份，两者的阳性符合率为100%，阴性符合率为87.5%，总符合率达到42.85%。该间接ELISA检测方法显示出了极高的敏感性、特异性、重复性，为DTMUV的快速诊断、抗体监测和流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。

9 结语

DTMUVD是2010年4月份在我国首次出现的对水禽高度致病的新型黄病毒病，传播迅速，尤其对鸭、鹅危害极大，建立和完善该病的诊断技术对预防和控制该病将具有十分重要的意义。仅仅2年多的时间内，我国兽医工作者在DTMUV的诊断领域就取得了重要进展，完成了病毒的分离鉴定及全基因组序列测定，建立了诸多分子生物学和血清学检测方法，为有效控制DTMUV的传播与流行提供了技术手段。同时全基因组序列的测定为研制基因工程疫苗提供了基本的理论数据，为分子生物学和血清学检测方法的建立提供了依据，为筛选抗原性良好的灭活疫苗和弱毒活疫苗等天然疫苗株奠定了基础。相信随着研究学者对DTMUV研究的不断深入，分子生物学和基因工程技术的不断应用，DTMUV的诊断方法必将日趋成熟和完善，从而为DTMUVD的预防和控制提供更加合理的科学依据，保障我国养鸭业的稳定、持续、快速发展。

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