鸡抗病毒免疫相关的TLR 信号途径研究进展

李海超，韩凌霞

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／实验动物中心，黑龙江哈尔滨150001；2.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

宿主的先天免疫系统能通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）有效识别病原微生物和寄生虫，其中研究较深入的是保守的跨膜蛋白Toll样受体（Toll－like receptor，TLR）家族，能识别固有保守的分子序列——病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMP），而PAMP是广泛存在于细菌、病毒、寄生虫和真菌的重要组成成分。此外，TLR能识别在感染过程中释放出来的一些配体，例如热休克蛋白。

迄今为止，在哺乳动物中发现了13种TLR，其中11种在人类中表达。在鸡已经获得的TLR，一些与人的TLR同源；一些与人的TLR缺乏同源性；甚至有些似乎是鸡所特有的。然而，鸡能对哺乳动物TLR激活剂的类似物产生应答。根据表达的位置，TLR可以分为两大类，即细胞膜上的TLR和分布于内体膜上的胞内TLR。

哺乳动物的TLR3、7、8和9能识别微生物的核酸并与抗病毒免疫有关，然而在鸡上能识别核酸配体的是TLR3、7和21。本文主要介绍在抗病毒免疫中鸡TLR的作用及其信号途径。

1 Toll样受体的信号途径

TLR是由胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域（Toll－白介素1受体同源结构域 Toll／IL－1 receptor，TIR）组成［1］，通过 TIR结构域与接头分子的同源区相互作用传递信号。除了TLR3外，所有已知的TLR都能利用已广为熟知的信号接头分子髓细胞样分化标志物88（myeloid differentiation marker88，MyD88）。MyD88包含死亡结构域，在MyD88与TLR的TIR相互作用后，MyD88的死亡结构域能募集IL－1R 相关因子（IL－1receptor－associated kinase，IRAK）家族的成员。然后IRAK蛋白从MyD88／TLR复合体中分离出来，再与肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor related factors，TRAF6）结合，调节下游信号途径。TLR3和TLR4又能募集第2个接头分子TRIF（TIR－domain－containing adaptor protein inducing interferon－β，TRIF）。TRIF活化启动 TRAF3依赖的信号级联反应，导致TRAF家族成员相关NF－kB激活剂连接激酶1的活化和二聚化作用，并抑制NF－kB激酶复合体，导致转录因子IRF3的去磷酸化，使IRF3转移到核内［2］。

2 细胞膜上的Toll样受体

在位于细胞膜表面的TLR中，鸡的TLR4和5与人 TLR 有同源物［3－4］。人 TLR1、6和10基因位于同一条染色体上。TLR1和TLR6编码的蛋白能与TLR2编码的蛋白分别形成异源二聚体，增加识别PAMP的范围。在鸡的基因组上与人TLR1、6、10同源的位置上仅仅包含2个基因，称为TLR1LA和TLR1LB［5］，意味着鸡TLR可能识别较小范围的PAMP。鸡有两个TLR2基因，被称为TLR2I型和II型或TLR2A和TLR2B［3］，它们编码的蛋白能分别与2个TLR1蛋白形成异源二聚体［6］，提示鸡可能采用不同的TLR识别与哺乳动物相似的细胞表面识别PAMP。

TLR能参与多种病原体的识别。TLR2和TLR4是细胞膜上2个重要的TLR，主要识别胞外病原体。例如，TLR2能识别细菌的脂多糖和多种真菌的PAMP［7］，而TLR4识别革兰阴性菌的肽聚糖。然而，近几年研究证明TLR2和TLR4在抗病毒应答中也起重要的作用。Barbalat R等［8］证明TLR2在脾脏和骨髓细胞中识别病毒，并通过未知的病毒配体活化TLR2，导致I型干扰素的产生，属于典型的抗病毒应答。TLR4在牛痘病毒免疫中的新作用已经被揭示。病毒感染TLR4功能缺失的小鼠，与野生型小鼠相比，其病毒复制、体温和死亡率均高于野生型小鼠［9］。对于TRL4来说牛痘病毒是一种新配体，而不是内源配体。

3 细胞内体上的Toll样受体

哺乳动物的TLR3、7、8和9位于细胞内体上，能识别核酸。TLR3识别双链RNA（dsRNA）和人工合成的激活剂poly（I∶C）；TLR7识别单链RNA（ssRNA）和合成的抗病毒咪唑莫特、Gardiquimod和R－848；TLR8与TLR7高度同源并能识别相似的合成抗病毒药物；TLR9识别DNA，特别是富含非甲基化的CpG序列的DNA。TLR9也能识别入侵细胞的病毒，这类TLR在抗病毒感染中特别重要。

鸡TLR3和TLR7与人TLR同源，能识别病原性核酸。鸡TLR8的基因是假基因，在进化史中的某个阶段已经丢失，并插入了大量的CR1重复序列。TLR9在鸡的基因组中是缺失的，但是鸡细胞还能对CpG序列产生快速应答［10］，而CpG序列是人TLR9的激活剂。鸡有两个特有的TLR：TLR15和TLR21［11］。已经证明鸡TLR21能识别CpG序列［12］。虽然能从TLR15胞外区的LRR预测所识别的病原体表面的PAMP，但TLR15的配体尚不清楚。

3.1 Toll样受体3

TLR3能识别dsRNA和合成的多聚类似物［13］，因而能通过识别被ssRNA病毒感染的吞噬或凋亡细胞中的dsRNA中间物起作用［14］。TLR3基因缺失小鼠对DNA病毒鼠巨细胞病毒（MCMV）易感［15］，提示通过来自DNA病毒基因组转录产物的二级结构可能产生dsRNA，在西尼罗病毒［16］和A型流感病毒［17］模型中能依赖TLR3方式产生前细胞因子，说明体内能产生dsRNA中间产物并被识别。尽管TLR3能对dsRNA产生应答并有效诱导IFN，但TLR3缺失导致病毒感染引起严重疾病，仍缺乏体内试验证据支持，因而有观点认为TLR3可能不是病毒的直接受体［18］。

但感染H5N1亚型禽流感病毒的鸡脾脏、肺脏和脑组织中 TLR3和INF－β、用poly（I∶C）体外刺激的鸡白细胞中TLR3和Ⅰ型干扰素、用poly（I∶C）体外刺激的鸡胚成纤维细胞系中，TLR3和1型干扰素都表现表达上调。利用siRNA沉默chTLR3后再用poly（I∶C）诱导，chTLR3和IFN－β的表达显著减少。上述研究提示鸡TLR3可能通过调节IFN－β的产生在抗病毒感染中起重要作用。

3.2 Toll样受体7

哺乳动物中，首个鉴定出能刺激TLR7和8的配体是咪唑莫特家族的成员，其结构与核糖核酸类似，因此咪唑莫特能有效刺激抗病毒反应，而富含G－U乃至Poly U的 RNA都有能力刺激TLR7［19］、但能有效刺激TLR7的精确结构序列或ssRNA序列还不确定。而宿主衍生的RNA很少能进入细胞并与胞内TLR接触，而且单链RNA极其不稳定，因为它们很快就被胞外的RNA酶降解。相反，病毒颗粒外壳能保护病毒RNA不被降解。吞噬小体内的病毒壳蛋白被降解后，释放出RNA，并被TLR7／8识别。

鸡TLR7有不同的mRNA剪接形式，它与鼠和人的TLR7相似，可能存在3种转录产物，其中两种是蛋白质亚基，其中一种的N端序列比另一种少4个氨基酸。鸡TLR7与人TLR7有63%的同源性。与其他TLR相似，鸡TLR7表达于多种组织。用RNA激活剂刺激鸡巨噬细胞HD－11细胞系和脾细胞，导致IL－1β、IL－6和IL－8表达上调，而IFN－ɑ或β不上调；诱导的细胞因子对氯喹敏感，暗示内体的酸化很重要。TLR7的激活剂洛索立宾在异嗜性白细胞中能下调此类相同的前炎症细胞因子，这与人的中性粒细胞相反。在HEK－293细胞系中用TLR7的激活剂咪唑莫特或Gardiquimod刺激，导致N F－κB活化。用H9N2亚型禽流感病毒感染鸡巨噬细胞，在感染初期鸡TLR7显著上调，而感染后期下降，这与前炎症细胞因子的上调或下调相一致［20］。

TLR7能通过信号接头分子MyD88在浆细胞样树突状细胞上诱导Ⅰ型干扰素。人免疫缺陷病毒、流感病毒和水疱性口炎病毒能刺激TLR7。流感病毒基因组能在小鼠树突状细胞中诱导产生TLR7依赖的IFN－ɑ。

3.3 Toll样受体21／Toll样受体9

细菌染色体中未甲基化的CpG序列是首个被鉴定出能活化TLR9的配体［21］，此后很多DNA病毒也被证明能活化TLR9，包括疱疹病毒［22］、腺病毒［23］和输血传播病毒家族［24］。甲型疱疹病毒和乙型疱疹病毒基因组都富含CpG序列。脾脏和骨髓中的单纯疱疹病毒1型和2型，能活化TLR9以产生前炎症因子和I型干扰素，在小鼠巨细胞病毒中也有相似的结果［25］。

通过人工设计合成含有CpG序列的寡脱氧核苷酸（CpG sequences of DNA nucleotides，OND）可以模拟未甲基化的CpG序列，作为TLR9／TLR21的配体。这些OND的免疫学效应已经在小鼠、人和其他哺乳动物中研究很多，表明这些效应是由TLR9介导的OND序列依赖性的。虽然TLR9在禽类的基因组上缺失，已经证明OND对鸡预防细菌感染有特殊的效果。用OND刺激体外分离的鸡外周血淋巴细胞、异嗜性白细胞和巨噬细胞HD－11细胞系都出现了免疫学反应 。

用外源性OND刺激表达鸡TLR21的哺乳动物HEK－293细胞系，能提高NF－KB的活化，但表达的鸡TLR7和15的则不能［26］；当TLR21RNA被部分沉默后，IL－1β、IL－6和iNOS的表达上调被显著抑制，而沉默TLR15没有此作用。鸡TLR21的活化依赖于特异性ODN序列，并需要CpG基序。TLR9活化的动力学反映现出正向协作关系，并且符合哺乳动物的变构活化模型。刺激鸡细胞、活化鸡TLR21的最佳OND序列，同样也是哺乳动物TLR9而不是鼠TLR9的激活剂 。

鸡TLR21位于转染细胞的内质网上，并且能被巴弗洛霉素A阻断，表明内体的酸化非常重要。因此，禽TLR21与哺乳动物的TLR9在功能上具有同源性，可能已经各自进化形成识别微生物DNA为危险信号，并立即引起先天免疫应答，启动适应性免疫的机制。鸡TLR21是否与鱼类或两栖类的TLR21同源需要进一步验证。TLR9可能也存在其他的脊椎动物中。已经证实了鸡TLR21能被五株弯曲杆菌染色体DNA激活，而不能激活人类TLR9［27］；人TLR9能被含高GC的细菌DNA高效激活例如分支细菌，它可能被低含量GC DNA低效的激活，例如弯曲杆菌。因此，禽TLR21识别的特异性范围可能比人TLR9更广泛。

鸡TLR21在新生鸡、老龄鸡和鸡胚中都有表达。与之符合的是新生雏鸡能对ODN产生应答，并且鸡胚或雏鸡接种过ODN［28］后都能抵抗沙门菌感染。Gp46（Hsp90β）对于胞内和胞外的TLR都是重要的蛋白。Bhat A等使用特异性抑制剂格尔德霉素证明在 HD－11细胞系中ODN的活化需要Hsp90，Western blot和质谱分析法显示Hsp90α与ODN相连接，而不是Hsp90β，这与哺乳动物不同，暗示Hsp90α在禽类中对于OND的活化可能更加重要。TLR时常相互协作，可能是由于利用了不同的信号途径。在鸡巨噬细胞中ODN被证明能与poly（I∶C）相互协作诱导一氧化氮，可以用鸡TLR21和TLR3通过不同的信号途径解释这一现象。

总之，哺乳动物的TLR7和TLR9在浆细胞样树突细胞（pDC）上高表达而在普通树突状细胞（cDC）上低表达，而pDC被认为在抗病毒中起主要的作用并且在刺激后能高水平产生Ⅰ型干扰素。近几年来已经能用分子标记技术从鸡中分离出DC，并且这些细胞在免疫中起作用，阐述禽类DC细胞亚类和他们所表达的TLR的特点，对更好地理解禽类免疫非常重要。

4 展望

病毒性疾病每年都能造成养殖业严重的经济损失。TLR是被广泛研究的先天性受体，在先天性和适应性免疫中的作用已被充分证实。然而，还存在更多的未知需要解答，如禽类免疫系统是如何通过已知和未知先天免疫受体对各种不同微生物（细菌、病毒、真菌）和寄生虫感染产生应答的。此外，其他动物，如鸭体内的RIG－I以及部分NLR家族的成员，在抗病毒感染中起很重要的作用，而鸡却缺失，表明TLR3、7和21在抗病毒免疫中可能起着比其他动物的同源物更重要的作用，这也为抗病毒疫苗佐剂研究提供了新的思路。

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