生精障碍动物模型的研究进展

范红艳，王艳春，顾饶胜，沈 楠，任 旷* (吉林医药学院:.基础医学院药理教研室;.实验中心机能实验室，吉林 吉林 303)

近年来随着工业化的发展、人们的生活方式的改变及生存环境不断恶化，男性精子质量急剧下降，不育症发病率日益增多，研究者试图找到合适的治疗男性不育的方法。男性不育症是临床上较为常见的性医学疾病之一，导致本病发生的原因较为复杂，如阳痿、早泄、精液异常(包括精子数量减少或无精子、活动率低下、畸形率增高及精液液化不良症等)及不射精症，其中精液异常所致者约占70% ～80%，故关于男性不育症研究的动物模型主要以精液质量异常性为主。本文将近年来的生精障碍动物模型研究进展作一综述，为男性不育研究和治疗药物开发研究提供一定的参考。现将各种造模方法介绍如下。

1 物理方法

1.1 热效应致生精障碍模型

哺乳类动物的睾丸对热十分敏感，故大多数雄性动物进化的结果是睾丸生长在腹腔外或腹腔浅表。睾丸组织局部温度低于体温，是精子生成的基本保证，哺乳动物阴囊温度低于正常体温2～3℃时，将影响精子的生成。故可利用热效应破坏睾丸与机体温差使睾丸温度升高造成精子生成障碍模型，热效应所致的睾丸功能的损伤程度取决于热暴露时间的长短［1］。

热效应手段一般包括温水浴、红外线、激光和超声波等，其中最简单的温水浴造模方法为:将大鼠阴囊浸没于43℃温水中15 min单次即可得到少精子症生精障碍大鼠模型［2］。各类生精细胞对热效应的敏感程度依次为粗线期初级精母细胞＞精子细胞＞细线前期初级精母细胞;A型精原细胞及支持细胞所受影响较小。大鼠生精障碍的损伤在热作用50 d后开始恢复。将猴子阴囊浸没于43℃温水每天30 min，连续两天，即可得到少弱精子症生精障碍猴子模型，睾丸局部热处理通过诱导生殖细胞凋亡使精子数量减少、活性降低［3］。

激光造模方法为:以连续输出的钕:钇铝石榴石(Nd:YAG)激光(输出功率为 7～10 W，波长为1.06 μm)对大鼠睾丸进行一次性照射，维持局部温度在(43±0.5)℃，持续15 min，对精子发生迅速产生抗生精效应，对间质细胞功能只产生暂时影响。

1.2 电离辐射致生精障碍模型

电离辐射的射线具有把能量传递给其所通过组织的特性，辐射的能量可使组织发生电离作用，包括水和生物大分子如DNA、蛋白质等。睾丸的生殖细胞对辐射敏感，可以引起生精上皮损伤，诱导细胞凋亡，导致精子数量明显减少［4］。有研究发现［5］，对小鼠骨盆局部照射(5 Gy)，即可损伤小鼠的生精能力。生精细胞对辐射的敏感性依次为:精原干细胞＞分化的精原细胞＞精母细胞＞精子细胞＞精子。分次照射方式所产生的破坏作用要比单次照射严重，损伤的表现与辐射剂量依赖性、细胞种类和细胞周期有关。电离辐射诱导生精细胞凋亡具有明显的细胞种类规律性，在较低剂量照射(0.025 Gy)时，以精原细胞凋亡为主，随剂量增加(0.05～0.2 Gy)才逐渐累及精母细胞，并且精原细胞凋亡率明显高于精母细胞，很少累及精子细胞和精子。小鼠睾丸具有较强的修复辐射损伤的能力，一般可部分或完全恢复生精能力［6］。辐射致暂时性生精功能损伤后的恢复时间随动物种属和精原干细胞的存活数量而异。一般情况下，小鼠恢复生育的时间为50 d。

2 化学方法

2.1 环磷酰胺致少精子症模型

环磷酰胺通过干扰DNA合成而阻碍生精细胞的有丝分裂，诱导睾丸生精细胞如精原细胞和精母细胞大量凋亡［7］，一般用于小鼠的少精子症造模，方法有各种剂量长期喂饲、一次超大剂量腹腔注射和连续大剂量腹腔注射等，其中较好的方法是连续大剂量腹腔注射环磷酰胺。冯波等人的实验［8］表明，给予小鼠腹腔注射环磷酰胺60 mg/kg，连续5 d，生精细胞和间质细胞可在末次给药后45 d内处于显著低水平。此法的优点是周期短、便于造模，但是其作用时间短，小鼠生精上皮再生速度快，造模后可供研究时间短，稳定性不超过末次给药后25 d，不适于连续性研究，可供选择的检测指标有限，使用剂量和作用时间尚有不确定性。在造模中会引起10% ～25%的动物死亡也是此法的重要缺点。

2.2 白消安致无精子症模型

白消安具有特异性地损伤小鼠生精干细胞和精原细胞的作用，从而破坏精子的产生，直接损害生精上皮，减少精子密度，减弱精子活性［9］。腹腔内单次注射白消安(40 mg/kg)后小鼠体重减轻，睾丸明显变小萎缩，曲细精管失去正常的生精上皮结构，基底膜未见明显的精原细胞，用药后4周，睾丸曲细精管呈支持细胞样表现，3个月有20%的曲细精管恢复生精。故可见，此种小鼠无精子症模型也是可逆的。

2.3 白消安和环磷酰胺联合致无精子症模型

由于各种单一化学药物造模方法均存在各种不同的缺陷(主要是动物生精能力的恢复时间)，有研究采用［10］白消安和环磷酰胺联合的方法，即给予小鼠一次性腹腔注射白消安10 mg/kg和环磷酰胺120 mg/kg，注射后第4周睾丸曲细精管内精子、精子细胞及精母细胞消失，仅可见少量初级精母细胞和精原细胞;12周时曲细精管内仅见基底层少许精原细胞，间质组织发生纤维化;20周时曲细精管仍保持无生精功能的状态，无明显恢复迹象，表明此种小鼠无精子症模型稳定可靠。

2.4 醋酸铅致无精子症模型

铅对精子发育和成熟有干扰和阻碍作用，并对精子有直接毒性。大量实验研究表明利用醋酸铅染毒可建立稳定的生精障碍动物模型［11］。给予小鼠灌胃醋酸铅20 mg/kg(连续染毒5 d)以上时，精子计数、直线运动精子数、活精子率随染毒剂量增加而下降，而静止不动精子数、精子畸形率和初级精母细胞染色体畸变率随剂量增加而升高，可见醋酸铅染毒大于20 mg/kg时可损害小鼠的生精功能。

2.5 雌激素致少/无精子症模型

雌激素导致雄性动物生精功能障碍是经典的造模方法。给予雄性SD大鼠炔雌醚(0.33 mg/kg)单独或与左炔诺孕酮(0.67 mg/kg)合用7 d，21 d后发现炔雌醚可干扰生殖细胞分化，导致精子生成减少、生育能力低下［12］。有研究［13］显示，青春期前己烯雌酚较大剂量［1.0 ～10.0 μg/(kg·d)×14 d］暴露对大鼠睾丸发育及功能有明显的近期(青春期晚期、性成熟后)和较远期 (成年期)毒性作用，该毒性作用随己烯雌酚的暴露剂量增加而加重，并随鼠龄增长而逐渐减退。大剂量雌激素可明显抑制血清睾酮分泌和精子生成，有研究［10］给予小鼠苯甲酸雌二醇4 mg/kg，连续注射15 d，注射后第4周，曲细精管内精子、精子细胞以及部分精母细胞破坏脱落消失，基底层可见部分精母细胞和精原细胞，造成生精功能的损害;注射后12周，曲细精管内可见精母细胞增多，20周时部分曲细精管内可以找到精子细胞和精子，表明部分小鼠睾丸生精功能恢复，提示此法难以构建稳定的少/无精子症动物模型。

2.6 甲醛致少精子症模型

液态甲醛和气体甲醛均具有小鼠生殖细胞毒性。气态甲醛能诱导早期精细胞微核率增加，均呈现一定的剂量－反应关系。有研究［14］表明甲醛吸入方法给药(10 ppm/1 h)35 d能引起大鼠精子密度、精子活动率和精子数减少。甲醛(10 mg/kg、30 mg/kg)小鼠腹腔注射，连续5 d，35 d后可见甲醛能引起精子数量减少，小鼠精子运动能力降低以及小鼠精子畸形率增高。提示甲醛能透过血睾屏障，干扰精子的生长、发育和能量代谢过程，对雄性生殖细胞具有潜在的诱变危害。

2.7 乙醇致少精子症模型

乙醇是一种确认致畸物，母亲孕期大量饮酒可致胎儿酒精综合征，男性酗酒可使性功能减退并引起后代发育和行为异常。研究表明长期给予大鼠灌胃乙醇(7.5 g/kg，连续 13 w)，表现为精子计数减少，精子活动率下降，精子畸形率明显升高，精子形态为某些生精细胞核固缩、变性，精子细胞变态期核固缩，曲细精管腔中脱落细胞增多，血清睾酮水平明显降低，由此可见乙醇会抑制精子生成和睾酮合成。

3 免疫方法

3.1 实验性抗精子抗体模型

采用人工免疫方法，将成年雄性Wistar大鼠断头处死，取双侧附睾，调精子数为3×109/mL，加入等量福氏完全佐剂混匀作为抗原，给实验组大鼠双侧腹股沟皮下多点注射鼠精子抗原作为首次免疫，10 d后于上述相同部位进行加强免疫，即可造成AsAb阳性模型［15］，可见大鼠精子凋亡率显著增加。

3.2 实验性睾丸纤维化模型

采用制造自身免疫性睾丸炎的方法，单侧睾丸内注射卡介苗，可建立大鼠睾丸纤维化模型［16］。结果肉眼可见纤维化睾丸较正常大鼠睾丸明显缩小，并出现生精细胞层数减少，生精细胞排列紊乱，生精上皮空泡化，生精细胞脱落、坏死等形态学改变。

4 手术方法

实验性隐睾模型:20日龄健康雄性SD大鼠1%戊巴比妥钠麻醉，开腹，切断一侧睾丸引带，将该侧睾丸固定于后腹侧壁层，制成单侧隐睾大鼠模型［17］，手术后7～14 d大鼠睾丸重量减少，生殖细胞的凋亡率明显增加［18］。或利用30～35日龄小鼠制作实验性隐睾模型，即将小鼠紧靠腹股沟管处结扎一侧阴囊，或缝合阴囊口，术后14 d和21 d后观察到部分生殖细胞排列紊乱，曲细精管则组织结构异常，曲细精管逐渐萎缩，管腔继续增大，生精上皮仅由精原细胞和一层初级精母细胞构成，隐睾侧睾丸生精小管直径逐渐变小，生精细胞数明显减少，初级精母细胞分界不清，未见精子细胞。

5 转基因/基因敲除方法

转基因技术为将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达可引起生物体性状可遗传的修饰。转基因动物的基因组中含有外源基因，但由于受遗传镶嵌性和杂合性的影响其有性生殖后代变异较大，难以形成稳定遗传的转基因品系，部分动物会发生精子生成障碍，成为无精子症或少精子症的不育动物，目前国内已经有此方面的报告［19］。

基因敲除技术是新的外源性DNA导入技术，它是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组，即外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生或纠正精确的基因突变。利用基因敲除方法可以获得无精子症或少精子症的雄性不育动物，研究［20］显示，Brek基因敲除的小鼠表现为无精子不育，其圆形精子阶段前发育正常，但不能变形发育为长形精子。故转基因/基因敲除动物的稳定性和普及还有待继续研究。

6 展望

目前建立的生精障碍动物模型均存在一定的不足，如化学方法在对生精功能损伤的同时，对机体其他系统的功能也会造成损伤、模型的稳定性欠佳等，因此研究者也不断在改良生精障碍动物模型上积极探索。本文对于生精障碍动物模型的总结，希望对男性生殖方面的药理研究提供一定的帮助。

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