辅助生殖技术对印记基因失调疾病及表观遗传影响的研究进展

孙 旖 综述，童晓文 审校

(同济大学附属第十人民医院妇产科，上海 200072)

1 辅助生殖和表观遗传

1.1 辅助生殖

人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)是20世纪70年代兴起的一种治疗不孕不育症的新方法，运用医学方法对配子、合子、胚胎人工操作，达到受孕目的的技术。含体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)、单精子卵胞浆内注射技术(intracytoplasmic single sperm injection，ICSI)、宫腔内人工授精(IUI)等，它为全球不孕不育患者带来了福音。但该技术涉及到诱导排卵、配子操作等非自然受孕过程，这些操作引起的表观遗传缺陷在老鼠的研究中明确的被观察到。基因印记相关疾病在ART下一代中的发生率有所增高，并作为辅助生殖的一个副作用被引起了更多的关注。

1.2 表观遗传与印记基因

表观遗传修饰(epigenetic modification)指在没有改变DNA的碱基排列顺序前提下对DNA双螺旋结构的修饰，只通过甲基化导致基因沉默或恢复活性。主要包括DNA修饰和组蛋白修饰，对细胞发育分化起着时空调控作用［1］。

基因印记又称基因组印记、配子印记，是近年来发现的某些基因呈亲源依赖性的单等位基因表达，属于表观遗传修饰的一种［2］，有这种现象的基因称为印记基因。其中，父系等位基因不表达者就称为父系印记，而母系等位基因不表达者就称为母系印记;父系印记基因主要包括H19、IGF2R、GRAB10、CDKN1C、TSSC3、MASH2等，母系印记基因主要包括 IGF2、PLAGL1、PEG、MEST 等［3］。其特征的标志是DNA甲基化/去甲基化，通常甲基化的DNA不具有转录活性，去甲基化则有转录活性.印迹基因簇内般都有个或几个印迹控制区，它调控着该簇内印迹基因的单等位基因表达［4］。在人体中称为印迹中心1(ICl)或差异甲基化区(DMR)。研究发现删除ICRs将导致该簇内印迹基因的印迹丢失［5］。

2 ART与印记基因失调疾病

近几年大量研究发现ART胚胎死亡率、后代的表观遗传病发病率高与印记基因表达异常相关，体外培养的过程中，胚芽印记基因经历着两个重塑期(配子形成期和植入前胚胎期)，是细胞发育的有关印记至关重要的阶段。研究显示ART可能会引起精子和卵子的印记基因甲基化的变化，使相关疾病的发病率增加［6］。ART和人类基因组印迹缺陷可能存在某种关系，需对 ART的安全性做进一步评估。

2.1 ART 和 BWS

Beckwith-Wiedemann氏症候群(Beckwith Wiedemann syndrome，BWS)临床最常见的五个特点是:巨舌症，巨大儿，中线腹壁缺损，耳朵的折痕或耳坑，新生儿低血糖。目前认为BWS的发生与染色体 1lp15.5 位点 KCNQ1、IGF2-H19、CDKN1C等基因印记异常有关。有研究发现BWS的1lp15.5位点KCNQ1 IC1区超甲基化，导致H19和Igf 2的印记丢失，Igf 2双等位基因表达，即本来母源印记的Igf 2激活并过度表达。而CDKN1C是一种生长抑制基因，它的表达下降会导致过度生长。

2003年有报道65例IVF生出3例BWS患儿3/65(4.6%)，比整个美国普通人群发病率0.8%高出约6倍。另一报道，7例ART出生BWS患者中，5例是ICSI后出生;并发现其中4例LIT1基因印记改变，1例LIT1、H19均发生异常据认为，这是由于被IVF打开或关闭了相关印记基因的表达程序。澳大利亚4 000例体外受精助孕儿童中，BWS的发病率比普通人群高几倍。总病例中有50%～60%的个体是DMR CpG甲基化错误导致的，而在ART所有案例都和母方KCNQIOTI DMR低甲基化相关，这个现象提示ART和印记基因调控之间的关联性。

此外，Mather等回顾研究大量的散发BWS病例，在确诊的149例BWS病例中6例是经ART(3例IVF、3例ICSI)出生的，得出 ART与BWS的关联性增高了4倍。其中2例中发现了KCNQ1OT1印记丢失和低甲基化。

2.2 ART 和 PWS、AS

Prader—wilIi综合征(PWS)和 Angelman综合征(AS)也是与印记相关的遗传病。PWS主要表现为肌张力低，身材矮小，性发育不完全，认知障碍，行为问题和长期饥饿的感觉，可导致过量进食而危及生命的肥胖。AS是一种神经遗传性疾病，有智力和发育障碍，睡眠障碍，或伴有癫发作，经常大笑或微笑着的特点。PWS/AS由同一印记区域的异常引起，在人上位于染色体15ql1—13，含父源表达的基因Mkrn3，Magel2，Ndn和 Snrpn等，及母源表达的基因Ube3a等。PWS是由于该区父源染色体丢失或父源表达的基因失活引起;而该区母源表达的基因(如Ube3a)被删除或表达不足，将导致AS。

国外有6例发生在ICSI的AS的报道，其中4例中有位点基因甲基化不足。有人认为ICSI是引起子代患AS最主要的危险因素原因是人15号染色体的母系甲基化建立于受精时或之后，此期发生AS的印迹缺失较多见。亦有报道400例AS中，没有与IVF和ICSI相关，却有7例和诱导排卵或IUI相关［7］。

2.3 ART 和 SRS

silver—Russell综合征(SRS)银罗素侏儒症，普通人群中发病率大约1/50 000至1/100 000胎。它涉及到H19和IGF2甲基化异常，约44%的SRS是由于H19 DMR低甲基化导致的。目前普遍认为和辅助生殖例如IVF相关［8］。至今有5例SRS是在IVF和 ICSI助孕的其中一个表现为父方 MEST DMR高甲基化。

在瑞士，31 850例 IVF儿童中，确诊了1个BWS，2 个SRS 和4 个PWS［9］丹麦全国范围的6 052个ART儿童中未发现基因印记疾病。在法国在15 162个IVF出生的儿童中，发现了6例BWS患者，但是没有发现PWS/AS或者SRS患者。总之，相对于1/3 700的BWS自然发病率，数据倾向于提示ART儿童有患BWS高风险。

3 ART对精子卵子印记基因甲基化的影响

报道过的ART中印记失调疾病均与基因印记缺陷有关。而ART体外培养的营养条件、操作过程、培养时间都有可能影响到生殖细胞印记基因的建立和维持［10］，尤其是其甲基化。甲基化易受外界环境影响，其表达异常会使受之调控的双等位基因表达和表达量成倍增加。DMR突变失活，可能会导致该区多个印记基因的异常表达，引起子代中印记基因相关疾病。

3.1 辅助生殖对卵子的表观遗传印记基因甲基化的影响

卵子的母方印记建立是从MⅠ期(减数分裂Ⅰ期)开始后直到MⅡ期(减数分裂Ⅱ期)受精前才完成，期间恰经历了ICSI，故推测母方印记更易受到ART体外操作的影响。ICSI注射之前取出卵丘的操作可能改变卵子正常的减数分裂，并且将精子顶体及消化酶类引入卵胞浆可能破坏卵胞浆内环境(学者认为ICSI是导致AS发病率增高的主要原因)。MⅠ期卵泡细胞约60%～70%的等位基因在KCNQIOTI DMR区域甲基化，而在IVF后该水平提高到90%［11］。那么ART下大约10%MⅡ期卵泡细胞可能导致BWS，但实际BWS发病率较低。此外体外培养的MⅡ期卵泡细胞中KCNQIOTI DMR甲基化水平有统计学意义的降低。

2/6的MⅠ卵泡细胞在诱导排卵之后会出现H19基因异常甲基化。诱导排卵的卵细胞MEST甲基化率比正常情况明显下降。

同时，超排卵的卵子在GV和MⅠ期间，父方DLK1和MEG3 DMR区域大部分未正常甲基化［12］。有人认为在体外培养的时间过短以至于卵细胞正常甲基化不全，使印记基因的异常表达(体内甲基化需36 h，体外培养24 h)。目前，此观点有争议，Geuns认为卵泡培养24 h就能完成正常的甲基化过程。

3.2 辅助生殖对精子表观遗传印记基因的影响

ART不大可能会影响精子的甲基化，因为父方印记基因在精子形成之前就已经建立。研究表明患有弱精症和少精症男性的子代患印记基因相关疾病的概率偏高。精子的密度和H19甲基化正相关和MEST甲基化负相关，弱精症精子表现为IG-DMR甲基化下降［13］。有报道称体外受精后患有SRS的一个小孩中，在他PEG1/MEST DMR，8个CPG过度甲基化，其中的4个在其父中亦过度甲基化。目前认为ART机械操作使缺陷精子避开了自然筛选直接用于受精，有问题的印记基因直接传递给下一代，而使相关疾病发病率增高。

3.3 辅助生殖体外培养和印记基因的关系

表观遗传印记基因对外环境的营养、激素很敏感。在诱导排卵之后，母方生殖道的生理异常增加了印记基因的失常几率。体外培养的卵细胞缺少正常排卵后母体激素刺激，母体内和体外培养环境差异会对子代印记基因甲基化有一定的影响。例如在Whitten’s培养液中培养会引起H19基因印记缺失，除了培养液成分以外，其他的相关因素如铵离子浓度、氧分压、温度及冷冻保存等也有可能改变基因印记的建立、修饰，但须相关方面进一步研究。

综上所述，从众多的实验数据中显示IVF、ICSI可引起基因印记改变引起相关疾病，但是ART一定会导致印记失调相关疾病的证据依旧不足，ART受孕是一个临床用药和实验室操作的复杂过程［14］，还值得进一步深入研究和临床观察，不能盲目轻易下结论。ART相关基因印记疾病发生机制目前有很多空白领域值得我们去研究和探索。但侧面也说明通过一定的操作有可能人为改变基因印记，这为进一步探索各个印记基因之间的相互作用机制提供了新的途径，如果辅助生殖能控制好印记基因的甲基化从而决定其表达，从这个突破点着手减少相关疾病的发生，提高ART质量。

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