干细胞移植治疗缺血性心脏病:从基础到临床

王志国，高连如

心血管疾病是世界范围内导致死亡的主要原因，全球每年约有1 700万人死于心血管疾病，其中因急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)和慢性心功能不全而导致的死亡占心血管疾病病死率的50%以上。循证医学研究表明，AMI即使早期成功血管重建也只能挽救缺血顿抑心肌。坏死心肌被纤维结缔组织替代，向心室重构进展，有超过30%的患者发展为慢性缺血性心力衰竭。随着人口的老龄化，心血管疾病患病率不断增加，缺血性心力衰竭的患病率及病死率也在逐年升高[1]。如何解决心肌细胞丢失是心血管疾病治疗中的关键问题。

20世纪末，美国科学家首次分离出人胚胎干细胞，并在体外成功建立了人胚胎干细胞系。与此同时，科学家发现，来自多种组织的成体干细胞可分化为其他胚层组织，即成体干细胞的可塑性。这项发现展现了生命科学的基础研究与临床应用的广阔前景，细胞移植替代坏死心肌细胞的理念应运而生[2-3]。2001 年 Orlic[4]将骨髓干细胞移植到小鼠梗死心肌后9 d可见移植细胞在梗死心肌存活，并分化为具有心肌表型特征的心肌样细胞，明显改善了心脏功能。从此，干细胞移植治疗缺血性心脏病迅速成为基础和临床研究的热点。

1 主要用于治疗缺血性心脏病的干细胞

1.1 骨骼肌源性干细胞 骨骼肌和心肌细胞同属横纹肌，骨骼肌源性干细胞来源广，取材容易是其优点。已经有临床研究表明，骨骼肌源性干细胞移植能够改善心功能。2003年巴黎比夏医院的Menasche等[5]对10例心肌梗死伴严重心力衰竭患者在行冠状动脉搭桥术同时进行骨骼肌干细胞移植，随访10个月虽心功能改善，但4例发生室性心动过速，都需安置除颤起搏器。2004年Siminiak等[6]对心肌梗死伴心力衰竭患者同样进行了骨骼肌干细胞移植术，术后依然有4例发生室性心动过速。上述研究结果表明，骨骼肌细胞和心肌细胞之间电偶联可能存在问题。Hagège等[7]对全球2001年首批进行自身骨骼肌干细胞移植的患者进行长达52个月的随访，发现这些患者心功能分级指数有明显改善，但也发现部分患者发生了室性心动过速而不得不植入自动体外除颤器(automated external defibrillator，AED)治疗。也有临床荟萃资料显示，未发现致严重心律失常[8]。因此，骨骼肌干细胞移植的研究结果矛盾，安全性一直处于争议之中，目前应用较少。

1.2 胚胎心肌细胞/胚胎源性干细胞 胚胎心肌细胞/胚胎源性干细胞目前仅有基础研究，而无临床研究报道。胎儿心肌细胞体内移植分化的研究表明[8]，急性心肌梗死大鼠模型制作成功后第5天将分离的胎儿心肌细胞分4点注射到心肌梗死区域。结果显示，移植组大鼠梗死瘢痕组织中可见新生细胞生长，可观察到移植的细胞间有闰盘连接。应用平滑肌a-肌动蛋白进行免疫组化染色证明，移植的胎儿心肌细胞已在坏死心肌区域存活、生长增殖。超声心动图可见细胞移植组大鼠左室收缩功能明显改善，并限制了心室进一步扩大的重构过程。胎儿心肌细胞虽具有最好的再生心肌能力，但其临床应用还存在许多问题，如伦理道德、法律以及免疫排斥、致肿瘤性等均有待解决[9]。

1.3 心肌源干细胞 心肌源干细胞目前已经有临床应用报道。长期以来，人们一直认为心肌组织是一种终末化组织。2001年美国纽约医学院Beltrami等[10]基础研究表明，心肌内存在心肌干细胞。此后，Beltrami等[11]应用胶原酶消化成熟心肌细胞，以Lin－c-kit+和Sca-1+作为心肌干细胞表达的分子标志，应用免疫磁珠分离到心肌干细胞经体外诱导分化，7～10 d后29%～40%细胞转化为心肌细胞，20%～26%细胞转化为内皮细胞，18%～23%转化为平滑肌细胞。将c-Kit+细胞注入冠状动脉结扎后大鼠梗死心肌，20 d后，梗死面积明显缩小，并可见冠状小动脉及毛细血管再生。也有基础研究报道Sca-1+心肌源干细胞移植未见到明显效果[12]。在2011年Lancet发表心肌源干细胞临床应用Ⅰ期临床注册研究报告，Bolli等[13]将自体心肌干细胞经冠状动脉移植治疗缺血性心肌病，入选患者全部有心肌梗死史，左心射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)＜40%，给予冠状动脉灌注心肌干细胞后4个月14例LVEF提高8%，1年LVEF提高12.3%，磁共振检查表明梗死范围减少24%，无任何不良反应。目前正在进行Ⅱ期临床试验。自体心肌源干细胞关键问题在于需要外科手术且取材难，能提取的干细胞数量少，需要进一步增殖。

1.4 骨髓源性干细胞 骨髓源性干细胞是目前临床应用最多的干细胞，来源于骨髓的各种干细胞群，包括造血干细胞、内皮祖细胞、单个核细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、侧群细胞等。尽管其细胞成分复杂，干细胞含量低，但是多数研究者一致认为骨髓源作为供体细胞是包含多种原始细胞的混合细胞群体。其不仅提供了多种组分混合的具有多向分化潜能的原始细胞，也提供了多细胞间相互依赖生存的分化诱导微环境，将最大限度地发挥骨髓干细胞的分化潜能，更好地保留了原始干细胞的归巢功能，更好的发挥了其旁/自分泌功能;且易于获取，细胞数目较多，避免了在体外长期培养的污染机会等诸多优点;最重要的是可以从自体获得，为自体干细胞，不存在伦理道德及免疫排斥问题。到目前为止，国外已发表20余个临床研究，在New England Journal of Medicine报道了几个较大的自体骨髓单个核细胞治疗AMI的多中心、随机对照甚至少数双盲临床研究[14-16]。Lipinski等[17]荟萃分析698 例 AMI，包括10个临床研究，其中7个是随机经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous transluminalcoronaryintervention，PCI)或PCI+骨髓单个核细胞经冠状动脉移植，LVEF平均增加3(1.9～4.1)%，左心室收缩末期容积(left ventricular end systolic volume，LVESV)平均减少7.4(2.7～12.2)ml，差异均有统计学意义;梗死面积平均缩小5.6(2.5～8.7)%。国内海军总医院心内科在2002—2010年进行了一系列自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植治疗缺血性心脏病的研究[18-21]，急性心肌梗死患者移植后3个月随访PET检查显示梗死区域内有代谢活力心肌增加，LVEF增加6.83%，而对照组单纯PCI手术者无改善;2年随访表明，骨髓单个核细胞移植组左室射血分数1年保持增加5.79%(P＜0.05)，2年增加3.79%(P＞0.05)，但LVEDV、LVESV无显著改善。有报道应用异体骨髓干细胞经静脉输注或安慰剂的随机双盲安慰剂对照临床试验结果表明，异体骨髓干细胞输注安全，无不良反应，左室收缩功能及左室重构均优于安慰剂组[22]。异体骨髓干细胞移植主要存在来源困难、医学伦理和免疫排斥等问题。

1.5 胚胎外组织来源的干细胞 如脐血MSCs、脐带MSCs、胎盘MSCs等，其病毒污染概率低、免疫源性弱，无社会、伦理和法律方面的争议。但脐血MSCs分离效率很低，脐带、胎盘细胞混杂，限制了在细胞治疗中的广泛应用。目前，比较有前景的是脐带华通胶(Wharton's jelly，WJ)源间充质干细胞。华通胶来源于胚胎发育13 d左右的胚外中胚层，包围在迁移中的胚胎血岛周围，是一种黏稠的富含黏多糖和蛋白聚糖的胶状物质，内含具有成纤维细胞和平滑肌细胞超微结构的成纤维细胞样细胞，被称为“肌纤维母细胞”。这些细胞在体外具备定向分化能力[23-24]，符合国际细胞治疗学会对MSCs的规定，因此称之为WJ-MSCs。WJ-MSCs增殖能力明显强于骨髓MSCs，在体外培养倍增时间短，7次传代后细胞数目可达300倍，传15～20代细胞亦无明显衰老。基础研究表明，人WJ-MSCs移植给心肌梗死大鼠可改善左心室功能[25]，目前已经有临床研究的安全性报道[26]。WJ-MSCs来源广泛，取材方便，无伦理争议，即使在剖腹产后48 h的脐带中仍可获得，具有较低的病毒污染率;而且冻存和复苏后存活细胞数量无明显减少，细胞结构和代谢无变化，可建库使用，是组织损伤细胞学治疗的理想选择。

1.6 经基因工程修饰的干细胞 部分临床试验结果表明，干细胞移植后心功能没有持续改善，考虑可能与干细胞的数量、生存情况和分化方向的不确定有关。选择合适的目的基因，通过载体组合转入干细胞中，有可能改善上述状况，从而提高移植的效果。目前基础研究有希望的基因:提高干细胞存活能力的抑制细胞凋亡的S100A1基因、AKT基因、bcl-2基因、Pim-1激酶基因等[27-30];促进干细胞归巢的CC趋化因子受体1(CC chemokine receptor type 1，CCR1)基因[31];也有报道编程 connexin-43、connexin-45[32-33]基因可改善分化后的干细胞与宿主心肌细胞的电偶联，减少移植后心律失常的发生。基因修饰干细胞应用于临床主要是安全性问题，基因插入可能引起某基因失活、重组，甚至激活癌基因;而且目的基因的表达程度也难以控制，表达过高是否存在不良反应仍不清楚，目前尚未应用于临床。

2 干细胞移植在心血管疾病治疗中的主要方法

2.1 经冠状动脉注射 经冠状动脉注射是应用最为广泛的移植方法[18-20]。其优点为细胞可以直接在介入治疗过程中给予，无需特别的器械，经靶血管移植至目的心肌区域;经动脉移植也能保证移植的细胞有血液供应。根据冠状动脉造影结果选用合理移植路径，以移植细胞最大程度达到靶区域为目的，如选用超选择性、左右主干灌注、侧支血管逆行灌注、桥血管灌注等，使注入细胞弥散均匀，保证血流灌注，有利于移植细胞分化生长。其缺点为细胞需要经过血管壁迁移至血管外，效率低于直接心肌内注射移植。

2.2 经心外膜和经心内膜心肌注射 直接心肌注射效率要优于经冠状动脉途径注射，但注射部位如为缺血心肌组织甚至为瘢痕组织，移植的细胞常不能够获得足够的血液供应;另外，局部注射移植很可能形成异常细胞岛，致心律失常不容忽视[5]。经心外膜注射骨髓单个核细胞通常是冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting，CABG)的一个补充治疗。经心内膜注射则需要特殊的器械(心内膜电机械标测系统)[34]，较为复杂。

2.3 经外周静脉注射 经外周静脉内注射法效率低于其他移植方法，有效性存在争议。有研究表明，在梗死心肌内没有发现移植归巢的干细胞[35-36]。

2.4 经冠状静脉注射 经冠状静脉注射需要采用复杂的导管系统伴行技术(经静脉心肌内注射)，尽管用球囊封堵，血流开放后血流方向会导致移植细胞流向心房，导致移植效率降低[37]。

3 干细胞移植治疗缺血性心脏病的机制

干细胞移植治疗缺血性心脏病的机制除了移植的干细胞分化为心肌组织细胞和新生血管外，移植细胞发挥的旁分泌作用目前越来越被重视。大量研究表明，移植的干细胞能够产生大量生物活性因子，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor receptor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、促肝细胞生长素(hepatocyte growth-promoting factors，HGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGF)、肾上腺髓质素、胸腺素β4、基质细胞源性因子-1α(stromal cellderived factor-1alpha，SDF-1α)、血小板源性生长因子、心房利钠肽(atrial natriuretic polypeptide，ANP)等，这些旁分泌因子的作用包括抗炎抗凋亡、减轻纤维化、促进新生血管生成、调节机体免疫、减轻心脏负荷的作用，从而最终修复受损组织并改善心脏功能[38-41]。

4 干细胞移植治疗缺血性心脏病存在的问题

基础和临床研究均已表明，干细胞具有广阔的应用前景。干细胞技术在带给人们无限希望的同时也带来了一系列的问题，其中首要的就是伦理问题。胚胎干细胞的利用将破坏生命的原始形态的胚胎，这方面伦理问题是公认的;更重要的是目前基础研究进展快速，使得“一切均有可能”，“生物技术将打开通往后人类(post-human)的大门”[42]，这是即将要面对的更深层的伦理问题。国家需要作出具有法律效力的规定，并根据技术的进展不断进行调整。而干细胞技术在临床应用仍面临远期安全、质量控制、移植细胞在不同心肌微环境下的分化方向及如何控制等一系列问题，需要进行广泛的临床试验。这些试验潜伏着诸多不确定因素，因而有着很高的风险。

总之，目前干细胞移植治疗心血管疾病的基础研究已经积累了大量的数据及结果，临床研究也取得了初步的成效，但是尚未能转化为临床的广泛应用。目前，关键问题是基础研究仍在进一步深入，但临床应用则一直没有实质性进展，远远落后于基础研究。所以，下一步研究的重点是总结并完善目前已有的基础研究成果，选择最安全有效的技术真正转化为临床应用。

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