脱氧雪腐镰刀菌烯醇的快速分离纯化及其抗体制备

洪淑娟，傅坚英，曹 娟，喻子牛，张吉斌（华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉430070）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素［1］，为雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol，NIV）的4－脱氧衍生物，属于单端孢霉烯族化合物。现已证实，禾谷镰刀菌、拟枝镰刀菌、梨孢镰刀菌等多种镰刀菌株以及头孢菌属、漆班菌属、木霉属等真菌都可产生DON［2］。

DON是一种霉菌毒素（Mycotoxin），对粮食、饲料和食品的污染非常普遍，对该毒素进行分离检测十分重要。由于目前市场上DON供应少，购买困难且价格昂贵，因此，有必要建立有效的DON分离纯化方法，为相关研究提供材料。真菌代谢毒素物质的分离纯化方法主要采用凝胶色谱法、硅胶层析法、离子交换法等，一般存在耗时长、回收率不高或一次处理样品量少等缺点。高速逆流色谱法（High－speed counter－current chromatography，HSCCC）［3－5］不使用固相载体作固定相，不仅费用低，避免了固相载体带来的样品预处理要求高、因不可逆吸附而引起的样品损失、失活变性等问题［6，7］，而且回收率高、分离量大。

免疫原的分子量一般在40 000以上。小分子物质的抗体制备相对于完全抗原来说较难。分子量小于5000的物质（半抗原）不足以达到刺激机体产生相应抗体的要求，需要与载体蛋白偶联后才具有免疫原性［8］。目前，对于分子中含有－COOH或可羧化的－OH的半抗原的偶联方法通常是：加入琥珀酸酐使－OH乙酰化生成含有羧基的半抗原，再在碳化二亚胺（DCC）催化下，与载体蛋白的氨基反应，制备完全抗原。

作者将高速逆流色谱法与高效液相色谱法相结合，快速从禾谷镰刀菌固体发酵产物中分离纯化DON，并将得到的高纯度DON用于其抗体制备。

1 实验

1．1 动物、试剂与仪器

雌性Balb／C小鼠，编号1＃～3＃。

乙酸乙酯（分析纯），甲醇（色谱纯），蒸馏水，4－二甲氨基吡啶（DMAP），琥珀酸酐（HS），牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂，DON标准品（Sigma－Aldrich公司），四甲基联苯胺（TMB）底物A液和B液。

TBE－300A型高速逆流色谱仪，上海同田生化技术有限公司；ATKA Prime泵系统、检测系统及组分收集系统；温控恒温水浴锅，北京博康医疗器械有限公司；LC－2010型高效液相色谱仪，日本岛津；旋转蒸发仪，上海申生；冷冻干燥机、超净工作台，上海博讯；ZDX－35BI型蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；生化恒温培养箱，黄石恒丰医疗器械有限公司；离子阱－飞行时间液质联用仪（LC／MS IT－TOF）；基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱仪（MALDI－TOFMS）。

1．2 菌株与培养基

禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）R6576，由西北农林科技大学真菌研究所提供。

PDA固体培养基：蔗糖2g，马铃薯20g，琼脂粉1．5g，蒸馏水100mL。

CMC液体培养基：纤维素1．5g，硝酸铵0．02g，酵母抽提物0．1g，蒸馏水100mL。

大米培养基：大米100g，蒸馏水50mL。

1．3 DON粗提物的制备

（1）菌株培养：挑取少量禾谷镰刀菌菌块于PDA固体培养基中央，在28℃、相对湿度75%条件下培养3～5d，菌丝呈白色，中央菌块呈玫瑰色。

（2）孢子液的制备：挑取上述菌丝接种于100mL CMC液体培养基，置于28℃、200r·min－1的摇床培养，期间显微镜观察，直至孢子部分或完全释放后，即制得孢子液。

（3）固体发酵：接种1%（质量体积比）的上述孢子液于已灭菌的3瓶大米培养基内，搅拌均匀后，置于28℃恒温培养箱培养，使大米最大程度地被真毒侵染，并不定期搅拌，使菌体均衡生长。

（4）DON粗提物的制备：向发酵的大米培养基内加入600mL甲醇，室温下摇床振荡过夜后，收集滤液，于40℃旋转蒸发浓缩以除去甲醇和大部分水，浓缩液再进行真空冷冻干燥后，作为高速逆流色谱的样品，－20℃保存备用。

1．4 高速逆流色谱法分离

分别将500mL乙酸乙酯、500mL水加入到分液漏斗中，摇匀后静置分层，上相作为固定相、下相作为流动相。将固定相以30mL·min－1的流速泵入高效逆流色谱仪主机的螺旋柱中，直至固定相流出达到平衡后，以正转转速890r·min－1［9］、流速1mL·min－1泵入样品。将DON粗提物溶于20mL流动相中，注入样品环，采用紫外检测器（检测波长为254nm）监测，根据色谱图收集各馏分。

1．5 高效液相色谱法分离和分析

采用高效液相色谱仪对经高速逆流色谱分离后各馏分进行纯化；通过比较待鉴定化合物与DON标准品色谱峰的保留时间进行定性。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱（5μm，4．6mm×250mm），流动相为甲醇－水（2∶8，体积比），检 测 波 长2 1 8nm，流 速1mL·min－1，柱 温25．0℃。

1．6 DON人工抗原合成

（1）半抗原DON－HS的合成

称取7mg DON、85mg HS、2mg DMAP于1．5 mL 离心管内［10，11］，加入1．2mL 脱水丙酮，并充分振荡使其完全溶解，置于80℃水浴锅反应4h（期间间歇补加脱水丙酮），反应结束后氮气吹干剩余丙酮；加入400μL蒸馏水，超声溶解管内物质，再加入800μL乙酸乙酯，充分混合后，超声溶解15min，保留含DONHS的乙酸乙酯层［12］。

（2）人工抗原 DON－BSA的合成

称取10mg BSA溶于2．5mL 0．13mol·L－1的NaHCO3溶液中，置于磁力搅拌器上，搅拌下加入DON－HS，于4℃ 反应20h，将反应液置于0．01mol·L－1PBS（pH 值7．4）中透析3d，期间每隔24h换液1次，透析后的物质即为免疫原DON－BSA，真空冷冻干燥，于－20℃保存备用。

包被原DON－OVA的合成方法同免疫原。

1．7 MALDI－TOF－MS质谱鉴定DON人工抗原

将DON－BSA偶联物用超纯水溶解成浓度为1mg·mL－1的样品，进行 MALDI－TOF－MS质谱鉴定。质谱条件：采样方法为线性高分子量阳离子模式，处理方法为线性高分子量内标法，激光强度为4500，分子量范围为20 000～100 000Da，采样次数为800次，上样量为0．3μL，MALDI基质为alpha－Cyano－4－hydroxy－cinnamic。

1．8 多克隆抗体制备、效价测定

取6～8周龄、体重20g左右的雌性Balb／C小鼠3只，将免疫原DON－BSA稀释至1mg·mL－1，与福氏完全佐剂以1∶1的比例乳化，经腹腔和皮下多点注射。初次免疫剂量为每只250μg。以后每隔14d免疫1次，免疫方法同初次免疫，但所用免疫原采用福氏不完全佐剂乳化。采用眼眶静脉丛采血，采第3次免疫血清，4℃过夜后，离心，收集上清，于－20℃保存备用。

采用间接酶联免疫分析法（C－ELISA）测定多克隆抗体的效价，具体步骤如下：（1）用pH值9．6的0．05 mol·L－1碳酸盐缓冲溶液稀释DON－OVA至终浓度为20μg·mL－1，包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；（2）PBST洗涤3次，用0．5%的卵清蛋白溶液封阻，每孔200μL，37℃孵育1h，PBST洗涤4次，拍干；（3）将小鼠多克隆抗体及阴性血清稀释成以下浓度：1∶4000、1∶10 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000，每孔100μL横向加入孔内，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干；（4）加入 HRP－标记羊抗鼠二抗IgG（1∶3000稀释度），每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，每次3min，拍干；（5）等体积混合TMB底物A液和B液，尽快加入酶标板孔内，每孔100μL，37℃显色5min，加2mol·L－1H2SO4溶液终止，每孔50 μL，设置酶标仪波长450nm，读数；（6）结果判定：P／N≥2．0，判为阳性（P、N分别为实验组小鼠和阴性小鼠血清的OD450值）。呈阳性时，血清的最大稀释倍数即为该血清的效价。

2 结果与讨论

2．1 高速逆流色谱分离结果（图1）

图1 DON粗提物的高速逆流色谱Fig．1 The high－speed counter－current chromatogram of crude extract of DON obtained

由图1可知，DON粗提物经高速逆流色谱分离后，有两个主要的色谱峰（A和B），将A、B所分布时间段的馏分合并，分别命名为馏分A、馏分B。色谱峰A峰形不规则，说明其应该由多种化合物产生，而色谱峰B规则、对称，说明其有可能由单一的化合物产生。根据高速逆流色谱在正转工作模式下，极性较大的化合物先出峰的原理，初步判定DON有可能存在于馏分B中。

2．2 高效液相色谱分离和分析结果

将高速逆流色谱分离收集得到的各馏分再分别经高效液相色谱分离。结果只有馏分B的高效液相色谱（图2）中具有与DON标准品相同保留时间的色谱峰，据此，可以初步判断馏分B中含有DON。收集含有DON色谱峰的馏分，真空冷冻干燥后，得到DON纯化样品。该纯化样品中含有的化合物主要为DON（图2）。

通过外标法定量分析，从300g大米发酵培养物中共得到8mg DON纯化样品，纯度为97．7%。

图2 标准品、纯化样品和馏分B的高效液相色谱Fig．2 The HPLC spectra of standard，purified sample and distillation cut B

2．3 LC／MS IT－TOF质谱鉴定半抗原合成

DON分子量为296．1，羟基进行随机乙酰化后进行LC／MS IT－TOF检测，结果见图3。

图3 DON－HS的LC／MS IT－TOF质谱图Fig．3 The LC／MS IT－TOF pattern of DON－HS

由图3可知，质荷比［M－H］＋＝495．1440，表明DON分子连有2个琥珀酸酐分子，质荷比［M－H］＋＝395．1274，表明DON分子连有1个琥珀酸酐分子，证明成功合成了半抗原DON－HS。

2．4 MALDI－TOF－MS质谱鉴定DON－BSA（图4）

由图4可知，DON－BSA人工抗原的分子量约71304．42Da，相对于蛋白BSA的分子量（66442．9375 Da）有很大的增加，表明有大量的DON分子被偶联在BSA上了，这就大大提高了实验动物产生针对DON的抗体的成功率。

2．5 多克隆抗体效价（表1）

由表1可知，间接酶联免疫分析法测定小鼠多克隆抗体效价，1＃和3＃小鼠的效价均为1∶32 000，2＃小鼠的效价为1∶8000。

2．6 讨论

为了从禾谷镰刀菌的固体发酵产物中得到纯化的DON，应用高速逆流色谱仪对粗提物中的DON进行分离，通过预实验，尝试了多种流动相及固定相组合，比较两相的分离常数，最终确定高速逆流色谱采用乙酸乙酯－水系统。

图4 BSA（a）和DON－BSA（b）的 MALDI－TOF－MS图谱Fig．4 The MALDI－TOF－MS patterns of BSA（a）and DON－BSA（b）

表1 抗DON多克隆抗体的效价Tab．1 The titer of DON polyclonal antibody

相对于Witt等［13］采用的硅胶色谱及薄层层析方法分离DON的研究结果，本研究具有明显的优势。首先，高速逆流色谱法操作较简单、快速、节省溶剂，且可以大量制备，成本低；其次，高效液相色谱法的灵敏度和效率方面明显好于薄层层析法，样品回收率也高，损耗小；通过高速逆流色谱进行分离后，可以得到浓缩的含有目标化合物的馏分，同时减少了样品量，有助于提高后续高效液相色谱纯化的效率和效果。将两种色谱法相结合可以快速分离获得高纯度DON。为此类毒素的相关研究提供了参考，具有较好的实际应用价值。

对于含不同基团的小分子，研究者所采用的人工抗原合成方法各有不同。本研究引入DMAP催化法对DON的羟基进行随机乙酰化，合成含羧基较多的半抗原，再与BSA和OVA进行偶联，基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱鉴定表明人工抗原制备成功，并通过免疫动物后，获得了较高效价的抗体。其中一只小鼠的多克隆抗体效价达到1∶32 000，高于以往报道的DON多克隆抗体的效价。

3 结论

利用高速逆流色谱法结合高效液相色谱法从禾谷镰刀菌固体发酵产物中分离纯化DON，首先以高速逆流色谱在乙酸乙酯－水（1∶1，体积比）为两相溶剂系统、温度为25℃、主机转速为890r·min－1、流速为1．0mL·min－1、检测波长为254nm的条件下进行分离，再采用高效液相色谱进一步分离纯化，从300g大米发酵培养物中得到了8mg DON，纯度为97．7%；将纯化的DON用于DON人工抗原制备，基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱分析表明，人工抗原制备成功；免疫动物后，研制出了高效价的多克隆抗体。本研究建立的色谱方法操作简单、分离效果较好，纯化的DON可以用于抗体的制备。

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