橘皮中柠檬苦素类物质的提取研究

杨 艳，潘雪雪，罗爱民，金 晶，吴海燕

（湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北 恩施445000）

橘子营养价值很高，橘皮中富含香精油、色素、柠檬苦素、果胶等天然物质［1］，但大部分未充分利用就被丢弃，既浪费资源，又污染环境。柠檬苦素类物质是一类高度氧化的四环三萜类次生代谢产物，主要存在于芸香科和楝科植物组织中［2］。20世纪60年代，Arigoni等［3］用化学和X－衍射的方法对柠檬苦素的结构进行了研究，1989年，Hasegawa等［4］首次发现了柠檬苦素类似物甙。近年来的研究表明，柠檬苦素类物质具有消炎镇痛、抗氧化性、抗肿瘤、抗焦虑等独特的生物活性［5－8］。

作者采用高效液相色谱法对柠檬苦素类物质含量进行测定，通过单因素实验考察了不同操作因素对低温微波辐射辅助提取橘皮中柠檬苦素类物质的影响，拟为开发利用废弃的橘皮自然资源提供参考。

1 实验

1．1 材料、试剂与仪器

橘皮购于恩施农贸市场。

柠檬苦素标准品（含量≥98%），上海金穗生物科技有限公司；溴化钾（光谱纯），乙腈（色谱级），无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、冰醋酸、98%硫酸均为分析纯，上海国药集团；水为超纯水。

1260Infinity Series型高效液相色谱仪，Agilent；AVATAR 370FTIR型光谱仪，Thermo Nicolet；DF－101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，上海羌强仪器设备有限公司；KQ2200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FA1004B型电子天平，上海佑科仪器有限公司；SHZ－D（Ⅲ）型循环水式真空泵，上海英化设备有限公司；800型离心机，上海云楼医用仪器厂；RE－52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；家用微波炉；NEXUS470型傅立叶红外光谱仪；YB－2型压片机，上海齐益电子仪器有限公司。

1．2 方法

预处理：将新鲜橘皮剪成大小基本一致（1mm2）的碎片，放到50℃恒温烘箱中烘干至水分＜5%；在装有适量石油醚的棕色瓶中浸泡8h，脱去橘皮中的油脂，过滤，自然风干；辅助处理：微波300W 辐射1 min；溶剂提取：具体提取流程如图1所示。

图1 橘皮中柠檬苦素类物质提取流程Fig．1 Extraction process of limonoids from citrus peel

设计单因素实验考察溶剂种类及其浓度、pH值、提取温度、提取时间、料液比（g∶mL，下同）对柠檬苦素类物质提取效果的影响。

1．3 分析检测

（1）HPLC色谱条件：Edipse plus C18色谱柱（4．6 mm×10mm，3．5μm）；流动相：乙腈－水（45∶55，体积比），流速：0．8mL·min－1；检测器：DAD紫外检测器；波长：210nm；检测温度：室温；进样量：10μL。检测之前通过扫描柠檬苦素类物质在190～400nm的紫外吸收，确定其最佳吸收波长为210nm。

（2）柠檬苦素类物质提取量测定：采用外标法，按下式计算：

式中：m为柠檬苦素类物质提取量，mg·g－1；A1为标准品色谱峰面积；A2为样品色谱峰面积；c为标准溶液质量浓度，mg·mL－1；V 为样品溶液体积，mL；S为样品稀释倍数；m样为样品质量，g。

2 结果与讨论

2．1 标准曲线的绘制

准确称量14．40mg柠檬苦素标准品（纯度≥98%）于小烧杯中，用流动相溶解，定容到25mL的容量瓶中，配成质量浓度为0．576mg·mL－1的柠檬苦素溶液。分别取0mL、0．2mL、0．4mL、0．6mL、0．8 mL、1．0mL上述柠檬苦素溶液置于10mL的容量瓶中，配成质量浓度（μg·mL－1）为0、11．52、23．04、34．56、46．08、57．60的标准溶液。以质量浓度（c）为横坐标、色谱峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

图2 柠檬苦素标准曲线Fig．2 The standard curve of limonin

由图2可知，柠檬苦素质量浓度在11．52～57．60 μg·mL－1范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。标准曲线拟合线性回归方程为：A＝10．9308016c－2．901838（R2＝0．99969）。

2．2 HPLC分析

将提取液样品处理后进行HPLC检测，样品与标准品的HPLC图谱如图3所示。

图3 柠檬苦素标准品和柠檬苦素类物质样品的HPLC图谱Fig．3 The HPLC chromatograms of limonin standard and limonoids sample

2．3 单因素实验结果与分析

2．3．1 溶剂对提取效果的影响

准确称取3．00g预处理后橘皮，选择无水乙醇、乙酸乙酯、水、丙酮、二氯甲烷为提取溶剂，考察不同溶剂对柠檬苦素类物质提取的影响，结果如图4所示。

图4 溶剂对柠檬苦素类物质提取的影响Fig．4 The effect of solvent on extraction of limonoids

从图4可以看出，无水乙醇提取效果最好，二氯甲烷效果最差，无水乙醇提取的柠檬苦素类物质是二氯甲烷提取的19．94倍。这是因为，二氯甲烷沸点太低，长时间回流过程中大量挥发，致使柠檬苦素类物质提取效果差。考虑到乙醇无毒、成本低、易回收利用，选择乙醇作为提取溶剂。

2．3．2 乙醇体积分数对提取效果的影响

分别以体积分数为30%、50%、70%、80%的乙醇和无水乙醇作为提取剂，考察乙醇体积分数对柠檬苦素类物质提取的影响，结果如图5所示。

图5 乙醇体积分数对柠檬苦素类物质提取的影响Fig．5 The effect of ethanol volume fraction on extraction of limonoids

从图5可以看出，随着乙醇体积分数的增大，柠檬苦素类物质的提取量显著增加，当乙醇体积分数为80%时提取效果最好；之后提取量明显减少，无水乙醇提取效果较差。这可能是因为，乙醇的体积分数过大时其极性也大，不利于弱极性、非极性类型的柠檬苦素类化合物的提取，致使提取量反而减少。因此，选择80%乙醇作为提取溶剂。

2．3．3 pH值对提取效果的影响

以80%乙醇作为提取剂，用冰醋酸和NaOH溶液调节提取体系的pH值，考察pH值对柠檬苦素类物质提取的影响，结果如图6所示。

图6 pH值对柠檬苦素类物质提取的影响Fig．6 The effect of pH value on extraction of limonoids

从图6可以看出，在酸性范围内，随着pH值逐渐增大，柠檬苦素类物质提取量不断增加；当pH值为5时提取量达到最大；当提取体系呈碱性时，柠檬苦素类物质提取量显著减少，pH值为10时的提取量仅为0．309mg·g－1。这可能是因为，强酸性条件下柠檬苦素类物质中的羰基和呋喃环不稳定，强碱性条件下羰基又容易发生开环反应，导致柠檬苦素类物质生成相应的苷元和葡萄糖［9］，而柠檬苦素类物质在pH值为5～7时相对稳定，提取效果较好。因此，选择适宜的pH值为5。

2．3．4 提取温度对提取效果的影响（图7）

图7 提取温度对柠檬苦素类物质提取的影响Fig．7 The effect of extraction temperature on extraction of limonoids

从图7可以看出，随着提取温度的升高，柠檬苦素类物质的提取量先增后减，在50℃时达到最大，为0．703mg·g－1。这可能是因为，升高温度可以加快植物有效成分的提取速率，增强提取效果，但温度过高会使柠檬苦素类物质热分解［10］转化成苷糖类物质，甚至丧失生物活性。因此，选择适宜的提取温度为50℃。

2．3．5 提取时间对提取效果的影响（图8）

图8 提取时间对柠檬苦素类物质提取的影响Fig．8 The effect of extraction time on extraction of limonoids

从图8可以看出，提取初期柠檬苦素类物质提取量随着提取时间的延长显著增加，在提取120min时最大，达0．734mg·g－1；随着提取时间进一步延长，提取量反而有所减少。这可能是因为，在适宜的温度下，延长提取时间有利于柠檬苦素类物质从橘皮组织细胞中扩散出来［11］；但提取时间过长时，副反应增多，反而导致提取量减少。因此，选择适宜的提取时间为120min。

2．3．6 料液比对提取效果的影响（图9）

从图9可以看出，随着料液比的减小即溶剂用量的增大，柠檬苦素类物质提取量显著增加；当料液比为1∶12时，柠檬苦素类物质提取量为0．693mg·g－1；进一步增加溶剂用量，柠檬苦素类物质提取量趋于平稳。理论上溶剂用量越大，柠檬苦素类物质提取越彻底，但溶剂用量过大不仅对提取液浓缩处理带来麻烦，也不经济。因此，选择适宜的料液比为1∶12。

图9 料液比对柠檬苦素类物质提取的影响ig．9 The effect of solid－liquid ratio on extraction of limonoids

2．3．7 验证实验结果

在单因素实验确定的优化条件下，即以80%乙醇为溶剂、pH值为5、提取时间为120min、提取温度为50℃、料液比为1∶12，进行3次平行实验，柠檬苦素类物质的平均提取量为0．856mg·g－1，表明所确定优化条件可靠。

2．4 红外光谱检测

将提取液样品经减压蒸馏、离心分离等纯化处理后得到白色晶体粉末，用KBr粉末压片进行红外光谱检测，结果如图10所示。

图10 提取物样品的红外光谱Fig．10 The FTIR spectrum of the extract sample

从 图 10 可 以 看 出，2919cm－1、1050cm－1、892cm－1处为β－取代呋喃环的特征吸收峰；2852cm－1处为甲基的C－H伸缩振动吸收峰；1744cm－1处为δ－内酯环的C＝O伸缩振动吸收峰；1699cm－1处为六元酮C＝O伸缩振动吸收峰；1357cm－1处为酮碳二甲基吸收峰；1279cm－1、1099cm－1处为环醚C－O－C吸收峰；1208cm－1、1129cm－1处为季碳二甲基吸收峰。将图谱信息与柠檬苦素红外标准图谱进行对比，结构特征相符，表明提取物确为柠檬苦素类物质。

2．5 讨论

实验对比了回流和索氏提取及提取次数的影响。结果表明：虽然索氏提取效果略好，但溶剂消耗量大，后处理繁琐；回流次数过多，易使柠檬苦素类物质分解转化，提取量减少，以回流2次为宜。故确定以回流法提取橘皮中柠檬苦素类物质，回流2次。

3 结论

（1）应用高效液相色谱法检测橘皮中柠檬苦素类物质含量，柠檬苦素质量浓度在11．52～57．60μg·mL－1范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。拟合线性回归方程为A＝10．9308016c－2．901838（R2＝0．99969）。

（2）单因素实验确定低温微波辐射辅助提取橘皮中柠檬苦素类物质的优化提取条件如下：以80%乙醇为提取溶剂、pH值为5、提取温度为50℃、提取时间为120min、料液比为1∶12（g∶mL），在此条件下回流提取2次，提取量为0．856mg·g－1。

（3）得到的柠檬苦素类物质结构经红外光谱检测确认。

［1］张珉，钟晓红．柑橘功能性成分研究进展［N］．中国农学通报，2009，25（11）：137－140．

［2］刘君．柑橘种子中类柠檬苦素提取纯化工艺研究［D］．重庆：西南大学，2008．

［3］Arigoni D，Barton D，Corey E J，et al．The constitution of limonin［J］．Cell Mol Lief，1960，16（2）：41－49．

［4］Hasegawa S，Bennett R D．Limonoid glucosides in citrus［J］．Phytochemistry，1989，28（6）：1717－1720．

［5］李赤翎，俞建，蒋雪薇，等．柠檬苦素类似物糖苷的抗菌与抗氧化作用研究［J］．食品科学，2008，33（5）：154－156．

［6］Poulose S M，Harris E D．Citrus limonoids induce apoptosis in human neuroblastoma cells and have radical scavenging activity［J］．Nutrition，2005，135（4）：870－877．

［7］邹连生．柑橘类柠檬苦素的提取、纯化和体外抗肿瘤的研究［D］．重庆：西南农业大学，2001．

［8］Wada K，Yagi M，Kurihara T，et al．Studies on the constituents of edible and medicinal plants．Ⅲ．Effects of seven limonoids on the sleeping time induced in mice by anesthetics［J］．Chem Pharm Bull，1992，40（11）：3079－3080．

［9］刘亮，戚向阳，董绪燕．柑橘中柠檬苦素类似物的研究新进展［J］．农产品加工·学刊，2007，（7）：37－41．

［10］Jitpukdeebodintra S，Chantachum S，Ratanaphan A．Stability of limonin from lime seeds［J］．Environ Agric Food Chem，2005，4（3）：30．

［11］蒋俊平，袁芳，吴兵，等．柠檬苦素类物质的研究进展综述［J］．中国酿造，2012，31（7）：10－14．