绳状青霉β－葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究

张 旭，刘华晶，黄晓梅，李 倩，徐诚蛟

（东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨150030）

全球石油资源逐渐枯竭，纤维素作为地球上最为丰富的资源，却没有得到合理利用，反而造成了一定程度的环境污染。因此，对纤维素的可再生能源开发是世界性的重要课题。第二代生物燃料技术能够以低成本的农林业废弃物以及木材加工废料为原料，通过微生物降解纤维素来生产燃料乙醇。目前，纤维素燃料乙醇技术的发展十分迅速，是公认的极有希望实现大规模工业化生产的生物质能源技术，而提高纤维素酶对复杂纤维结构的降解效率是其工业化的关键因素之一［1］。

长期以来，人们对纤维素降解酶的研究主要集中在木霉属（Trichoderma）和曲霉属（Aspergillus）等菌株，其中瑞氏木霉（T．reesei）及其变异菌株为高效产纤维素酶的代表菌株，而对青霉（Penicillium）纤维素降解酶系的研究相对较少。与瑞氏木霉相比较，青霉不仅能高效分泌β－葡萄糖苷酶（β－Glucosidase）［2］，而且拥有更全面的降解天然木质纤维材料的酶系组分［3，4］。van Wyk［5］比较绳状青霉（Penicillium funiculosum）与瑞氏木霉的胞外纤维素酶水解活性时发现，在少数底物的降解中，绳状青霉能够得到更高浓度的葡萄糖。自Wood等［6］在20世纪80年代首先分离纯化绳状青霉的纤维二糖水解酶后，关于绳状青霉纤维素降解酶系的纯化与克隆的研究逐渐增多［7］，但对于绳状青霉β－葡萄糖苷酶的研究仍相对较少。

作者以一株野生绳状青霉为研究材料，经离子交换层析与凝胶过滤层析，从粗酶液中初步分离纯化出一种低分子量β－葡萄糖苷酶（EC 3．2．1．21），并对其酶学性质进行初步研究。

1 实验

1．1 菌株与培养基

从常年堆放麸皮的仓库取样，分离得到一株青霉，经形态学和分子生物学鉴定为绳状青霉（Penicillium funiculosum），命名为P07M12。

斜面培养基：PDA培养基。

种子培养基（g·L－1）：葡萄糖 1．0，纤维素粉3．0，KH2PO42．5，（NH4）2SO41．5，MgSO4·7H2O 0．3，CaCl2·H2O 0．3，FeSO4·7H2O 0．0005，ZnSO4·7H2O 0．0015，蛋白胨2．5，酵母膏2．0，pH 值5．0。

发酵培养基（g·L－1）：麸皮 10．0，乳糖 6．0，KH2PO43．0，MgSO4·7H2O 0．5，CaCl2·H2O 0．5。

1．2 试剂与仪器

DEAE－Sephadex A－25、Sephadex G－100、Sephadex G－50由Pharmacia公司进口分装；对硝基苯－β－D－吡喃半乳糖苷（pNPG）、纤维素粉、Tris碱、丙烯酰胺，Sigma公司；其它试剂为国产分析纯。

Power Pac200 型 蛋 白 电 泳 仪，Bio－rad；Minifors型发酵罐，瑞士Infors公司；TU－1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；台式高速离心机，上海飞鸽仪器厂；摇床，上海森信实验仪器有限公司；透析袋，Whatman；Alphalmager 2200型凝胶成像系统，Alpha Innotech Corporation；LKB－100型自动部分收集器，瑞典Pharmacia公司。

1．3 酶的分离纯化

1．3．1 粗酶液制备

用接种环在斜面培养基上刮取少量孢子于无菌水中，制成孢子悬液，吸取5mL接种于100mL种子培养基中，于30℃、150r·min－1振荡培养48h，然后以10%的接种量接入装有1L发酵培养基的发酵罐中，于30℃深层发酵10d，将发酵液用8层灭菌棉纱过滤后，于4℃、8000r·min－1离心20min，取上清作为粗酶液待用。

1．3．2 硫酸铵粗提

粗酶液用饱和度20%～80%［8］的硫酸铵盐析，对沉淀进行分析，确定β－葡萄糖苷酶盐析量最大时的硫酸铵饱和度。将硫酸铵盐析溶液于4℃放置过夜，5000r·min－1离心10min，去上清，用适量pH值7．8的50mmol·L－1Tris－HCl缓冲溶液溶解沉淀，将粗酶液放入透析袋中，于4℃过夜，再加入适量聚乙二醇脱水浓缩。

1．3．3 DEAE－Sephadex A－25柱层析

将1．3．2浓缩酶液上样到预先用pH值7．8的50 mmol·L－1Tris－HCl缓冲 溶 液 平 衡 好 的 DEAESephadex A－25离子交换层析柱上，用同一缓冲溶液配制NaCl梯度（0～0．3mol·L－1）洗脱液，以1mL·min－1的流速洗脱，收集洗脱液，用紫外分光光度计测定蛋白质浓度与酶活力，合并高酶活力部分，用聚乙二醇除盐浓缩。

1．3．4 Sephadex G－100柱层析

将1．3．3浓缩酶液上样至预先用pH值4．8的50 mmol·L－1Tris－HCl缓冲溶液平衡好的Sephadex G－100凝胶过滤层析柱（1．6cm×100cm）上，用同一缓冲溶液洗脱，收集洗脱液，分别测定蛋白质浓度与酶活力，合并高酶活力部分，浓缩，得纯化酶液A，测定蛋白质分子量。

1．3．5 Sephadex G－50柱层析

将1．3．3浓缩酶液上样至预先用pH值5的50 mmol·L－1Tris－HCl缓冲溶液平衡好的Sephadex G－50凝胶过滤层析柱（1．6cm×100cm）上，洗脱液流速为0．5mL·min－1，收集洗脱液，测定蛋白质浓度与酶活力，合并高酶活力部分，浓缩，得纯化酶液B，测定蛋白质分子量。

1．4 酶学性质研究

1．4．1 最适反应温度的测定

将纯化酶液适当稀释，分别在不同温度环境（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）下，以活力最大值为100%，用pNPG法测定β－葡萄糖苷酶的相对酶活。

1．4．2 最适反应pH值的测定

将纯化酶液放入不同pH值环境［2．5～4．5（醋酸）、5．5～7．5（磷酸）、8．5（Tris－HCl）］中，以 pNPG为底物，于60℃反应30min，测定相对酶活。

1．5 分析与检测

1．5．1 酶活力的测定

用pNPG法测定酶活力［9］。以pNPG为底物，在pH值4．8的50mmol·L－1醋酸缓冲溶液中，于40℃水浴保温反应10min后，立即加入2mL 1mol·L－1Na2CO3溶液终止反应，测定吸光值OD410，以对硝基酚的生成量表示酶活力。

1个酶活单位（IU）定义为：每分钟每毫升酶液分解pNPG释放1μmol对硝基酚所需的酶量。

1．5．2 蛋白质浓度的测定

采用紫外吸收法测定蛋白质浓度［10］。测定蛋白质中酪氨酸与色氨酸残基在280nm处的吸光值，从而获取相应溶液中蛋白质的浓度。

1．5．3 蛋白质分子量的测定

采用 SDS－PAGE凝胶电泳系统［11］测定β－葡萄糖苷酶纯度。在Tris－甘氨酸电泳缓冲溶液（Tris 1．51g、Gly 9．4g、SDS 0．5g，加去离子水定容至500mL）体系中，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过Alphalmager 2200型凝胶成像系统分析凝胶图像，比对标准蛋白计算纯酶相对分子质量。

2 结果与讨论

2．1 β－葡萄糖苷酶的纯化

2．1．1 硫酸铵粗提结果

通过对硫酸铵饱和度的筛选，确定在饱和度为30%～50%的硫酸铵作用下，β－葡萄糖苷酶盐析量最大，经盐析除去了大量杂蛋白。

2．1．2 DEAE－Sephadex A－25柱层析结果（图1）

由图1可知，在280nm处有明显光吸收的蛋白峰共4个，β－葡萄糖苷酶主要集中在峰Ⅰ（2＃～4＃收集管）和峰Ⅲ（20＃～22＃收集管）。通过 DEAE－Sephadex A－25纯化后，去除了大量杂蛋白，β－葡萄糖苷酶纯度得到很大程度提高，从1．6倍提高到7．2倍。

2．1．3 Sephadex G－100柱层析结果（图2）

由图2可知，仅3＃收集管有明显β－葡萄糖苷酶活性，其浓缩后即为纯化酶液A。SDS－PAGE分析表明，纯化酶液A中β－葡萄糖苷酶（酶A）的分子量为120kDa。与Ramani等［12］从绳状青霉NCL1中分离得到的β－葡萄糖苷酶的分子量（120kDa）相同。

2．1．4 Sephadex G－50柱层析结果（图3）

图3 Sephadex G－50柱层析Fig．3 Chromatogram ofβ－glucosidase purified by Sephadex G－50

由图3可知，在280nm处有明显光吸收的蛋白峰有3个；蛋白质峰Ⅱ（11＃收集管）的比酶活力最高，达到19．5IU·mg－1，其浓缩后即为纯化酶液B。SDSPAGE分析表明，纯化酶液B中β－葡萄糖苷酶（酶B）的分子量为19kDa。

2．1．5 β－葡萄糖苷酶的分离纯化结果（表1）

表1 β－葡萄糖苷酶的分离纯化结果Tab．1 Results of isolation and purification ofβ－glucosidase

由表1可知，粗酶液依次经硫酸铵沉淀、DEAESephadex A－25柱层析、Sephadex G－50柱层析后，β－葡萄糖苷酶纯度提高到8．1倍。

2．2 β－葡萄糖苷酶B的酶学性质

2．2．1 最适反应温度

考察反应温度对β－葡萄糖苷酶B活性的影响，结果如图4所示。

图4 反应温度对β－葡萄糖苷酶B活性的影响Fig．4 Effect of reaction temperature on β－glucosidase B activity

由图4可知，β－葡萄糖苷酶B在40～60℃范围具有较高活性，60℃时相对酶活最高；60～70℃之间的热稳定性良好，70℃时仍能保有63．5%的相对酶活；但70℃以上相对酶活迅速降低。表明β－葡萄糖苷酶B的最适反应温度为60℃。

2．2．2 最适反应pH 值

在60℃下，考察反应pH值对β－葡萄糖苷酶B活性的影响，结果如图5所示。

由图5可知，β－葡萄糖苷酶B在pH值3．5～5．5范围具有较高活性，pH值为4．5时相对酶活最高；当pH值超过5．5后，随着pH值的增大相对酶活快速下降。因此初步确认β－葡萄糖苷酶B为酸性酶，其最适反应pH值为4．5。

2．3 讨论

图5 反应pH值对β－葡萄糖苷酶B活性的影响Fig．5 Effect of pH value onβ－glucosidase B activity

目前，对于绳状青霉β－葡萄糖苷酶组分分离纯化的研究相对较少，仅Ramani等报道绳状青霉NCL1能够产生120kDa的β－葡萄糖苷酶。本研究从绳状青霉P07M12的发酵液中分离得到与Ramani分子量同为120kDa的β－葡萄糖苷酶（酶A），并首次分离纯化出分子量为19kDa的β－葡萄糖苷酶（酶B），通过对其酶学特性的研究，确定其最适反应温度为60℃、最适反应pH值为4．5。

近年来，人们认识到绳状青霉较木霉具有分泌较高水平β－葡萄糖苷酶、降解木质纤维的各酶系组分之间能高效协同作用的特点，在木质纤维素降解领域具有很大的优势与潜力。本研究首次从绳状青霉的纤维素降解酶系中分离得到一种小分子量β－葡萄糖苷酶，对进一步研究绳状青霉纤维素水解酶系的代谢调控与降解木质纤维素的作用机理具有重要意义。

3 结论

绳状青霉（Penicillium funiculosum）粗酶液经硫酸 铵 沉 淀、DEAE－Sephadex A－25 离 子 交 换 层 析、Sephadex G－50凝胶过滤层析等步骤，获得了一种凝胶电泳均一的未知的β－葡萄糖苷酶，经SDS－PAGE测得其分子量为19kDa，其最适反应温度为60℃、最适反应pH值为4．5。

［1］Sticklen M B．Plant genetic engineering for biofuel production：Towards affordable cellulosic ethanol［J］．Nat Rev Genet，2008，9（6）：433－443．

［2］Mishra C，Rao M．Mode of action and synergism of cellulases from Penicillium funiculosum［J］．Appl Biochem Biotechnol，1988，19（2）：139－150．

［3］Jrgensen H，Morkeberg A，Krogh K B R，et al．Production of cellulases and hemicellulases by three Penicilliumspecies：Effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis［J］．Enz Microb Technol，2005，36（1）：42－48．

［4］孙宪昀，曲音波，刘自勇．青霉木质纤维素降解酶系研究进展［J］．应用与环境生物学报，2007，13（5）：736－740．

［5］van Wyk J P H．Saccharification of paper products by cellulase fromPenicillium funiculosumand Trichoderma reesei［J］．Biom Bioen，1999，16（3）：239－242．

［6］Wood T M，McCrae S I，Macfarlane C C．The isolation，purification and properties of the cellobiohydrolase component of Penicillium funiculosumcellulase［J］．Biochem J，1980，189（1）：51－65．

［7］Sahasrabudhe N A，Ranjekar P K．Cloning of the cellulase gene fromPenicillium funiculosumand its expression in Escherichia coli［J］．FEMS Microbiol Lett，1990，54（1－3）：291－293．

［8］Wood T M，McCrae S I．Purification and some properties of a（1→4）－β－D－glucan glucohydrolase associated with the cellulase from the fungus Penicillium funiculosum［J］．Carbohydrate Res，1982，110（2）：291－303．

［9］Deshpdende M V，Pettersson L G，Eriksson K E．Selective assay for exo－1，4－β－glucanases［J］．Methods in Enzymology，1988，160：126－130．

［10］Bradford M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］．Analytical Biochemistry，1976，72（1－2）：248－254．

［11］李如亮，王延枝，张楚富，等．生物化学实验方法［M］．武汉：武汉大学出版社，1998：79－84．

［12］Ramani G，Meera B，Vanitha C，et al．Production，purification，and characterization of aβ－glucosidase of Penicillium funiculosumNCL1［J］．Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，167（5）：959－972．