7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮的合成及其与牛血清白蛋白的相互作用研究

杨绪红，胡大为，王晓东，刘 颖，於 智

（湖北科技学院核技术与化学生物学院，湖北 咸宁437100）

吖啶酮类化合物是一类具有良好生物活性的氮杂环化合物，具有杀菌、消炎、镇痛和抗癌等作用［1，2］。7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮（Y）是含有吖啶酮药效团的化合物之一，同时由于其羰基的邻位含有α－H，可以与其它药物基团进行分子对接，因此也是进一步合成新药物的优良中间体。

作者参照文献［3］，以5－氯－2－氨基二苯甲酮与1，3－环己二酮在碘催化下合成7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮（Y）。通过IR、1HNMR、13CNMR、MS及元素分析对其结构进行了确证；并用荧光猝灭法在模拟人体生理条件下研究 7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，得出两者相互作用的结合常数、结合位点数及热力学参数，拟为该类物质的合成及生物活性研究提供理论依据。7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮的合成路线见图1。

图1 7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮的合成路线Fig．1 The synthetic route of 7－chloro－9－phenyl－3，4－dihydroacridin－1（2 H）－one

1 实验

1．1 试剂与仪器

5－氯－2－氨基二苯甲酮；1，3－环己二酮；牛血清白蛋白（BSA）；三羟基甲氧基氨基甲烷（Tris试剂）；其它试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

Shimadzu IRPrestige－21 型 红 外 光 谱 仪；JEOL－500MHz型核磁共振仪；VarioELⅢ型元素分析仪；HP5988A型质谱仪；YRT－3型熔点仪（温度计未经校正）；JA5003型电子天平；F－4500型荧光光度计（带恒温系统）；PH－3C型酸度计；CS501型超级恒温器。

1．2 方法

1．2．1 7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮的合成

在50mL圆底烧瓶中加入1．1575g（5mmol）5－氯－2－氨基二苯甲酮、0．8338g（7．5mmol）1，3－环己二酮、10mL无水乙醇、0．0127g碘，在恒温35℃条件下磁力搅拌反应12h，减压脱除溶剂，将所得固体用无水乙醇重结晶，即得黄色产物，产率80%，熔点184～185℃。

1．2．2 7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮与 BSA相互作用的研究

参照文献［4］分别配制5．0×10－5mol·L－1BSA溶液及2．0×10－3mo1·L－17－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮溶液，于0～4 ℃保存。在模拟人体生理条件下（pH＝7．4），固定BSA的量，激发波长为295 nm，测定 7－氯－9－苯 基－3，4－二 氢 吖 啶－1（2 H）－酮－BSA（Y－BSA）体系的荧光光谱，考察7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮对BSA 的荧光猝灭情况；然后测定不同温 度 下 7－氯－9－苯 基－3，4－二 氢 吖 啶－1（2 H）－酮 对BSA的荧光猝灭情况，以确定荧光猝灭机理；最后计算7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮与 BSA 相互作用的结合常数、结合位点数及热力学参数，确定作用力类型。

2 结果与讨论

2．1 产物结构表征

通过IR、1HNMR、13CNMR、MS及元素分析对产物结构进行确证。

1HNMR（CDCl3，500MHz），δ：8．0061～7．9877（d，J＝9．2Hz，1H），7．6991～7．1529（m，7H），3．3726～3．3474（t，J1＝6．3MHz，J2＝6．4MHz），2．7233～2．7107（t，J1＝6．3MHz，J2＝6．85MHz），2．2641～2．2515（d，J＝6．3MHz）；13CNMR（CDCl3，125MHz），δ：197．86，162．26，150．61，147．12，136．95，132．71，132．51，130．27，128．45，128．01，127．99，126．84，124．52，77．42，77．17，76．92，40．70，34．63，21．36；IR（KBr），ν，cm－1：3068，3022，2953，1700，1601，1473，1385；MS（ESI），m／z：308（［M＋H］＋）；C19H14NOCl元素分析实测值（理论值）：C 74．15（74．08），H 4．58（4．75），N 4．55（4．51）。所有数据解析均与目标化合物结构相符，证明成功合成了7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮。

2．2 7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮对 BSA 荧光光谱的影响（图2）

图2 7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮对BSA荧光光谱的影响Fig．2 The fluorescence spectra of BSA in the presence of 7－chloro－9－phenyl－3，4－dihydroacridin－1（2 H）－one

由图2可知，BSA在375nm附近有较强的荧光峰，随着体系中7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮浓度的增大，BSA的内源荧光强度有规律地降低，而峰的形状保持不变，说明7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮对 BSA 的荧光有猝灭作用。

2．3 荧光猝灭机理

荧光猝灭过程分动态猝灭过程与静态猝灭过程。动态猝灭过程中随温度的升高猝灭常数相应增大，静态猝灭过程中随温度的升高猝灭常数相应减小［5，6］。荧光猝灭遵循Stern－Volmer方程［7，8］，即：

测定温度分别为298K、302K、306K、310K时7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮对 BSA 的荧光猝灭情况，绘制Stern－Volmer曲线，见图3。

图3 不同温度下，Y－BSA体系的Stern－Volmer曲线Fig．3 The Stern－Volmer plots of Y－BSA system at different temperatures

根据式（1）计算pH＝7．4时不同温度下的猝灭常数KSV，见表1。

表1 不同温度下的猝灭常数KSV／×105 L·mol－1Tab．1 The quenching constant KSVat different temperatures／×105 L·mol－1

由表1可知，随着温度的升高，KSV减小，表明7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮对 BSA 的荧光猝灭过程为静态猝灭过程。

2．4 结合常数与结合位点数

7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮与 BSA 的表观结合常数Kb和结合位点数n根据式（2）计算［9］：

绘制不同温度下的lg［（F0－F）／F］～lg［Y］曲线，见图4。

图4 不同温度下，Y－BSA体系的lg［（F0－F）／F］～lg［Y］曲线Fig．4 The lg［（F0－F）／F］～lg［Y］plots of Y－BSA system at different temperatures

依直线的斜率和截距求得化合物7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮与 BSA 的表观结合常数 Kb和结合位点数n，见表2。

表2 结合常数Kb和结合位点数nTab．2The binding constant Kband the binding site n

由表2可知，在298K、302K、306K、310K下的平均结合常数为3．9044×104L·mol－1，结合位点数约为1，表明7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮分子与BSA分子以1∶1结合。

2．5 作用力类型

蛋白质与小分子之间的作用力类型可根据反应前后热力学常数焓变（ΔH）和熵变（ΔS）的正负来判断：ΔS＞0、ΔH＞0时，为疏水作用力；ΔS＜0、ΔH＜0时，为氢键和范德华力；ΔS＞0、ΔH≈0时，为静电引力［10－12］。热力学参数可根据式（3）、式（4）计算：

绘制 Van′t Hoff曲线（lnK～1／T 曲线），见图5。

不同温度下的热力学参数ΔH、ΔG、ΔS见表3。

由表3可知，ΔH＞0、ΔS＞0，表明7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮与BSA的作用力类型主要是疏水作用力。

3 结论

图5 Van′t Hoff曲线Fig．5 The Van′t Hoff plot

表3 不同温度下7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮与BSA作用的热力学参数Tab．3 The thermodynamic parameters for the interaction between 7－chloro－9－phenyl－3，4－dihydroacridin－1（2 H）－one and BSA at different temperatures

7－氯－9－苯基－3，4－二氢吖啶－1（2 H）－酮对牛血清白蛋白（BSA）具有良好的静态猝灭作用，其相互作用的结合常数为3．9044×104L·mol－1，结合位点数约为1，主要作用力类型为疏水作用力。

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