春季保护地小型西瓜苗期枯萎病和叶枯病初步鉴定

2013-08-09戴照义吴金平王运强郭凤领韦向阳

长江蔬菜 2013年16期

戴照义，吴金平，王运强，郭凤领，韦向阳

（湖北省农业科学院经济作物研究所，武汉，430064）

早春保护地西瓜上市早，价格高，经济效益好，近年来在湖北发展较快，其对西甜瓜嫁接苗的巨大市场需求促进了工厂化育苗的快速发展。但由于部分小型育苗场设施简陋，环境调控能力差，加上不注重种子处理，苗期频发多种病害。2012年3～4月，湖北省低温阴雨持续时间长，宜城市小型苗场发病较重。湖北省农业科学院经济作物研究所对其中发生较为普遍的2种病害进行了分离、鉴定，以期对其防治起到指导作用。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从湖北宜城市流水镇育苗场西瓜苗上采集病样，图1-a病样的病部有粉红色霉状物，图1-b病样的病部呈水渍状，用组织分离法[1]分离病原菌，然后纯化、保存。

1.2 致病性测定

根据柯赫氏法则[2]进行寄主活体接种，接种菌丝，以清水为空白对照，3次重复。出现田间相同的症状时再次分离，并将2次获得的分离菌作比较，以确定该菌病原菌。

图1 西瓜苗期病害症状

1.3 DNA提取

将病原菌菌块移至马铃薯蔗糖培养基（PSA）平板上，25℃黑暗条件下培养48～72 h，然后将菌落边缘的菌丝切成2～3 mm的菌落小块，把4～5块菌丝移至PSA液体培养基，28℃、180 r/min振荡培养2 d。将液体培养好的病菌菌丝，在双层尼龙网上过滤，用水洗涤2次，以除去菌丝内的培养液，收集菌丝，将其包好放在硅胶中过夜，吸干水分，用液氮研磨成粉末，参照Knapp等[3]报道的CTAB（Cetyltrim-ethyl ammonium bromide）法提取病菌菌丝DNA。

①PCR引物病原菌rDNA的ITS区域PCR扩增选用的引物分别为ITS-F和ITS-R，其碱基序列如下[4]：ITS-F（5'-GTCCTAACAAGGTTTCCGTA-3'），ITS-R（5'-TTCTCCGCT TATTGATATGC-3'）。

②PCR混合物 10 mmol/L三磷酸碱基脱氧核苷酸 0.6 μL，20 mmol/L 氯化镁 1.2 μL，缓冲液 2.0 μL，加 10 μmol/L 引物 ITS-F 和 ITS-R 各 1.0 μL，2 U/μL Taq 酶 1.0 μL，模板 1.0 μL，使用超纯水将反应体系补至 20 μL。

③PCR反应热循环参数设置为94℃预变性4 min；94℃ 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，循环 36次；72℃延伸6 min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测到600 bp左右的条带，将病原菌基因组PCR扩增产物回收，回收片段与克隆载体进行pGEM-T连接，然后转化至大肠杆菌DH-5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，选取阳性菌落扩大培养后，部分菌液用M13进行PCR扩增，凝胶电泳检测，并将检测后确认含有目的片段的阳性克隆送到华大基因测序公司测序，将测序结果提交GenBank进行分析。根据序列分析和形态学鉴定的结果，对所分离的病原菌进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 病原菌回接鉴定

菌丝接种第5天病部有粉红色霉状物（图 2-a）和水渍状（图 2-b），与田间症状相同。从回接表现症状的病叶中再次分离到病原菌。

2.2 病原菌的rDNA-ITS序列验证

用病原菌 rDNA的ITS区域进行扩增，均扩增出约600 bp的特异性片段（图3）。测序后通过GenBank软件比对序列：病样1-a分离获得的菌株1～2的rDNA ITS序列与Fusarium oxysporum的相似度达99%，而西瓜枯萎病的致病菌是尖孢镰刀菌西瓜专化型（F.oxysporumSchl.f.sp.niveum（E.F.Smith）Snyber et Hansen），初步判断所得病菌为西瓜枯萎病致病菌[5]。病样1-b分离获得的菌株3～4的rDNA ITS序列与半知菌交链孢霉属（Alternaria sp.）的序列相似度高达99%，西瓜叶枯病的致病菌是瓜链格孢菌（A.cucumerin），初步判断所得病菌为西瓜叶枯病致病菌[6]。

3 小结与讨论

西瓜枯萎病和叶枯病均可全生育期发病，且以中后期发病为主，传播途径以土壤和病残体带菌为主，种子也可携带病菌。本研究中苗期大量发病与嫁接育苗过程中过度保湿、连续阴雨、光照不足、种子消毒不彻底等有关。

图2 分离的两个菌回接症状

本研究所收集的2个病样，1-a病样的病部有粉红色霉状物，这与已经报道的西瓜枯萎病症状相似；1-b病样的病部初为水渍状小点，后扩展成浅褐色至褐色、圆形或半圆形的水渍状病斑，这与已报道的西瓜叶枯病症状相似[7]。但为了进一步确定病害病原菌，本研究利用位于rDNA上的高度保守序列作为通用引物对病原菌进行PCR扩增，然后将PCR产物通过连接、转化并测序，所得序列通过GenBank上的Blast，确定其分类地位。该方法最大优点是适用于所有真菌研究，最大缺点是必须通过测序才能确定病原菌分类地位。而根据特定生物ITS区域的DNA序列设计出来的特异引物，因为不同物种间ITS序列的变异性较大，所以只有与特异性引物相对应的真菌才能扩增出相应的ITS产物。扩增产物电泳后，只需检查有无扩增条带即可得出明确的结果[8]。因此，下一步将设计特异引物辨别西瓜不同病害的致病种，使检测速度更加快捷，时间更加缩短，最终使其指导实际生产。