青藏高原禽源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆及序列分析

安 娜，张红见，刘光辉，赵 静，陈 刚

（青海大学农牧学院，青海 西宁 810003）

禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌引起的鸡和火鸡等禽类的一种接触性传染病。目前控制多杀性巴氏杆菌病的疫苗主要有强毒的灭活菌苗，弱毒活菌苗，这些疫苗在一定程度上对多杀性巴氏杆菌病的防治起到了一定的作用，但因多杀性巴氏杆菌的毒力因子具有多样性、血清型多、免疫谱窄、保护期较短以及易产生耐药性等原因［1］，以致本病仍未能得到有效的控制，特别是在青海省每年都有散在发生，造成了较大的经济损失。

外膜蛋白H是多杀性巴氏杆菌最主要的外膜蛋白，属于孔蛋白，其所具有的性质均提示孔蛋白能够成为既能诱导机体产生同源保护又能产生异源保护的一种良好的候选疫苗［2］。本试验选择禽源多杀性巴氏杆菌分离株的ompH基因作为研究对象，以期了解青藏高原禽源Pm与其他菌株在遗传特点、进化规律上的关系，以及ompH应用于疫苗的可行性，为研制更为有效的禽类地方血清型亚单位疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株 标准菌株：C47-8（牛源），购自中国兽医药品监察所；野生菌株分离自西宁市某鸡场病死鸡肝脏；对照菌株：肺炎克雷伯氏菌（ATCC700603）、大肠埃希菌（ATCC25922）、伤寒沙门菌（ATCC 14028），均由中国农业大学预防兽医学教研室馈赠。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank上公布的多杀性巴氏杆菌ompH基因保守序列，采用Primer Premier 5.0软件，设计合成了1对引物ompH3，引物 序 列 如 下：Forward Primer 5′-AGCAGTAGCAGCAACTTCAGCAAA-3′；Reverse Primer 5′-CCC-GCACCTAAGATGATAGCACGA-3′，目 的基因片段长度928bp，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 菌株模板DNA的抽提 C47-8、对照菌及P1004模板DNA的抽提操作步骤依照TaKaRa公司生产的MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit使用说明书进行。

1.4 PCR反应条件及体系 PCR反应体系：50μL反应体系：加入Premix Taq25μL，Forward Primer 1μL，Reverse Primer 1μL，模板 DNA 1μL，ddH2O 22μL。PCR反应条件：94℃5min，94℃30 s，72℃1min，72℃10min，4℃5min共30个循环，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 P1004ompH基因的克隆 将回收的扩增片段连接到pMD18-T载体，转化入DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16h，将疑似阳性克隆的白斑选出，转接到新的Amp＋的平板中37℃培养12h，将经过PCR鉴定的阳性克隆菌液送往上海英骏生物技术有限公司测序3次，将禽源Pm的ompH序列与GenBank上公布的C47-8及9个国内外代表株进行同源性分析。

2 结果

2.1 ompH基因的扩增 用自行设计的ompH3引物对标准菌株C47-8、阴性对照菌株肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌和P1004进行ompH基因的PCR扩增，得到与预期结果相符的928bp的目的片段，作为阴性对照的肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希菌和伤寒沙门菌均未扩出（见图1、图2）。

2.2 P1004ompH基因的鉴定 将回收后的P1004株和C47-8菌株的PCR产物与pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，随机挑取单个白色菌落，转接到新的Amp＋的平板中37℃培养12h后，进行PCR鉴定，均扩增到了预期的片段，然后送往上海英骏生物技术有限公司测序。

2.3 测序及同源性分析

2.3.1 禽源P1004ompH基因编码区核苷酸及推导的氨基酸序列与标准菌株及国内外代表株同源性比较结果，见表1。

将禽源多杀性巴氏杆菌ompH基因编码区核苷酸及推导的氨基酸序列与标准菌株及国内外代表株同源性进行比较，结果禽源P1004菌株和标准菌株C47-8之间的ompH基因编码区核苷酸及推导的氨基酸序列的同源性分别为62%和91.7%，表明此次分离的禽源Pm菌株ompH基因序列与标准菌株C47-8之间存在明显差异；禽源多杀性巴氏杆菌P1004ompH基因序列与GenBank中公布的国外代 表 毒 株 AY603962、AY864815、DQ054529、DQ415729、EF635423、DQ417895、EU016232、U50907和PMU52200的同源性在55.9%～65.2%之间，其中最低的是与PMU50907，同源性为55.9%；最高的是DQ417895，同源性也仅为65.2%。以上分析结果显示，禽源多杀性巴氏杆菌P1004ompH基因编码区核苷酸序列同源性与国内外大部分多杀性巴氏杆菌菌株ompH基因编码区核苷酸序列同源性差异较大。

2.3.2 ompH基因编码区核苷酸与其推导的氨基酸序列比较结果 经核苷酸序列比较，结果显示，P1004和C47-8的序列差别很大，在第129等141个位点上都存在变异，在506～507位点发生基因缺失；与国内代表株AY864815和EF635423相比，在第54位等92个位点发生突变，506～507位上出现基因缺失；与国外代表株AY603963和DQ054529相比，在第88位等79个位点发生突变，在506～507位基因缺失；由图3可知，将P1004和C47-8 ompH基因推导的氨基酸序列比较分析，显示其氨基酸序列与C47-8同源性较高，为91.7%。在第21位等25个位点发生变异，在第66位等134个位点发生基因缺失；与国内代表株AY864815和EF635423相比，在21、72、128、135～136、157位发生变异，在66～68、170～298位发生缺失；与国外代表株AY603963和DQ054529相比，在第21位等22个位点发生变异，在170～298位发生基因缺失。

表1 11株多杀性巴氏杆菌ompH基因编码区核苷酸及推导的氨基酸序列同源性

图3 11株多杀性巴氏杆菌ompH基因编码区推导的氨基酸序列比对图

3 讨论

3.1 据报道，纯化的ompH能诱导100%保护率，与全菌诱导的保护率相当［3］；ELISA检测结果表明，ompH和全菌都能诱导高水平的抗体。在同种菌的不同菌株中，孔蛋白的一级氨基酸序列、二级结构及与抗原性有关的区域相对保守［4］，ompH蛋白的这一特性为多杀性巴氏杆菌的鉴定及保护性抗原片段的筛选提供了一个新的方向，使ompH有望成为一种对所有血清型的Pm产生保护的候选抗原。

3.2 曹素芳等曾将血清A群的禽巴氏杆菌C48-1株ompH基因与已知的15个血清型及疫苗株CU的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较，核苷酸同源性在51.5% ～98.7%之间，氨基酸同源性在39.3%～98.7%之间［1］.本试验中P1004和标准菌株C47-8的ompH基因编码区核苷酸序列的同源性为62%，氨基酸序列的同源性为91.7%；与已知的9个国内外代表株进行比对分析，核苷酸同源性在55.9%～65.2%之间，说明禽源Pm ompH基因编码区核苷酸序列同源性与国内外大部分Pm菌株ompH基因编码区核苷酸序列同源性差异大。但是氨基酸序列比较结果显示，不同血清型菌株的ompH同源性很高，在91.3%～91.7%之间，提示ompH作为疫苗使用可能提供同源和异源保护，但有待进一步进行表达及免疫保护试验研究。

［1］王娉，张富春.多杀性巴氏杆菌毒力因子的研究进展［J］.地方病通报，2006，21（2）.

［2］Luo Y，Glisson J R，JackwoodM W，et al.Cloning and characterization of the major outermembrane p rotein gene（om pH）of Pasteurella m ultocida X-73［J］.J Bacteriol，1997，179：7856-7864.

［3］Galdiero M，Folgore A，Nuzzo，et al.Adhesion and Transmigration Through Bovine Endothelial Cells in vitro by Protein H and LPS of Pasteurella m ultocida［J］.Immunobiology，2000，202（3）：226-238.

［4］曹素芳，黄青云，韩先干，等.禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因克隆及序列分析［J］.中国预防兽医学报，2006，28（3）：253-256.