贵州荔波传统酸肉发酵期间理化成分与发酵风味物质分析

张 倩，郭晓芸，张海松，范丽平，任国平

(1.杭州万向职业技术学院生物技术系，浙江 杭州 310023；2.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550022)

酸肉是一类有着悠久历史的乳酸细菌型发酵肉制品，是侗、苗、布依族等少数民族居民生活中的重要肉食产品[1]，有着丰富的饮食文化内涵。酸肉也是我国少数民族地区特色性的发酵肉制品，由于风味独特、营养丰富、色鲜味美而成为许多少数民族非常喜爱的一种民间发酵肉制品[2]。目前，有关发酵肉方面的研究报道较多[3-8]，但对其加工过程中理化成分、发酵代谢产物分析缺乏系统深入的研究，致使酸肉加工过程中的一些关键性技术问题尚未得到解决，诸如无优质发酵剂、无统一的加工技术标准、产品风味与传统产品的风味相比还有差异，从而使其质量受到一定影响，在一定程度上限制了酸肉的大规模现代化生产。国内已有学者对传统酸肉的微生物菌相变化、找出产品中的优势菌群并筛选性能优良的微生物菌种，从而开发肉用人工发酵剂的研究开始关注[9]，生产发酵肉制品所使用的微生物发酵剂多数还依赖进口。酸肉是自然发酵的肉制品，其中含有多种有益微生物，这些微生物是肉类专用发酵剂的重要生物资源，具有巨大开发潜力[10-16]。因此，有必要对不同地域的传统“酸肉”发酵体系中理化成分和微生物发酵产物的动态变化进行分析。本实验对贵州荔波当地传统酸肉发酵过程中不同阶段肉制品的理化成分和微生物发酵风味物质进行动态观察并分析其变化规律，以期为传统酸肉工业化发酵过程控制以及酸肉产品质量的提高提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选择贵州荔波生产销售量最大的两种坛装传统自然发酵酸肉，分别标记为传统酸肉1和传统酸肉2两个处理组。每个处理样品总量为3.5kg(0.35kg×10坛)。从入坛发酵开始，发酵60d内每隔10d分别从2个处理组中随机抽出1坛，进行理化分析。

1.2 仪器与设备

5417R超速离心机 德国Eppendorf公司；L-8800氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司；HP6890/HP5975C型GC/MS联用仪 美国安捷伦公司；BS110S型电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；HI-98128袖珍型防水pH计 广州市盛华化工科技有限公司；磁力搅拌器 金坛市大地自动化仪器厂；DK-89-1型恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；722光栅分光光度计 上海分析仪器总厂；D.D.S-300型组织捣碎机 长沙市西区红星电器厂；BCD-248W型保鲜冰箱 美萎集团合肥电冰箱厂；CS101-2型电热鼓风干燥箱 重庆实验设备厂；KDN-04A定氮仪 上海昕瑞仪器有限公司；LD4-2型低速离心机(4000r/min) 北京医用离心机厂。

1.3 方法

1.3.1 pH值的测定

测定方法按照 GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》规定的方法，将样品绞碎后，称取10g，加入90mL 蒸馏水浸提20min，过滤，取上清液用pH计测定。

1.3.2 水分含量的测定

测定方法按照 GB/T 5009.3—2010《食品中水分的测定》的直接干燥法。

1.3.3 总糖含量的测定

按GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》及GB 9695.31—2008《肉制品总糖含量测定》方法测定。

1.3.4 蛋白质含量的测定按照 GB/T 9695.11—2008《肉与肉制品氮含量测定》的凯氏定氮法测定。

1.3.5 脂肪含量的测定按照 GB/T 9695.7—2008《肉与肉制品总脂肪含量测定》的索氏提取法测定。

1.3.6 总酸含量的测定按照马勇等[17]方法测定。

1.3.7 氨基酸态氮含量的测定

按照马勇等[17]的方法测定。

1.3.8 挥发性盐基氮含量的测定

采用GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中的半微量定氮法，计算公式如下：

式中：V1为样品消耗0.0100mol/L HCl溶液体积/mL；V0为空白实验消耗0.0100mol/L HCl溶液体积/mL；m为样品质量/g。

1.3.9 游离氨基酸的分析

氨基酸的分析：使用氨基酸分析仪，按照国家标准GB/T 18246—2000《饲料中氨基酸的测定》对上述样品处理液进行分析。仪器分析条件：4.6×150mm 2619#离子交换色谱；洗脱液流速0.225mL/min；茚三酮流速0.3mL/min；柱压80～130kg/cm2；茚三酮压力15～35kg/cm2；氮气压力0.28kg/cm2；柱温53℃；标准样品浓度3nmol/50μL；每个样品的分析时间为74min。

1.3.10 风味成分分析

酸肉样品提取：取适量发酵结束后的终产品，切碎，加经重蒸后的AR级正己烷5mL，回流提取1.5h，分离正己烷溶液，提取酸肉风味成分。

气相条件：色谱柱为AB-INowax (30.0m×250μm， 0.25μm)弹性石英毛细管柱，柱温45℃(保留2min)，以5℃/min升温至240℃，保持15min；汽化室温度250℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压5.08psi，载气流量1.0mL/min；进样量2μL(正己烷溶液)；分流比20：1。

质谱条件：电子电离源(electron ionization，EI)；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压982V；接口温度280℃；质量范围m/z 20～450。

1.3.11 有害物质检测[18]

H2S测定：有些细菌可分解培养基中含硫化合物，从而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。采用硫化亚铁琼脂培养基。挑取被测液体，沿管壁穿刺，于(36±1)℃条件下培养1～2d观察，产硫化氢者使培养基变为黑色。

吲哚测定：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰红色吲哚化合物。试验采用蛋白胨水作为培养基，挑取少量被测液体接种于培养基内，于(36±1)℃条件下培养1～2d，必要时可培养4～5d，加入欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者与液面接触处呈玫瑰红色。

亚硝酸盐测定：采用亚硝酸盐试剂盒比色法。

2 结果与分析

2.1 pH值变化

从图1可以看出，传统酸肉在0～10d环境中营养丰富，条件适宜，多种微生物都能得到生长繁殖的机会，乳酸菌生长迅速[19]，环境中的pH值急剧下降；10～30d时，厌氧和兼性厌氧微生物成为优势菌，产酸速度逐渐减缓，从而在20～30d内将pH值维持在稳定的范围内；30～45d内，pH值持续下降。此时，pH值达到最低(pH3.85)，酸度口感适宜；45～60d时，pH值出现回升现象，这是微生物分解蛋白质，产生了一些氨及胺类等碱性含氮物质的结果[19]。

图 1 荔波传统酸肉发酵期间pH值的变化Fig.1 pH change of Libo sour meat during fermentation period

2.2 水分含量的变化

图 2 荔波传统酸肉发酵期间水分含量的变化Fig.2 The change of water content in Libo sour meat during fermentation period

图2表明，在整个发酵期，水分呈现总体下降的趋势，其中以前40d最为明显。荔波传统酸肉的初始水分含量为56.32%，最终产品的水分含量为40.22%。水分下降速率前40d较快，以后略有所下降。这主要是由于发酵过程中乳酸菌生长迅速[19]，产品的pH值下降快，从而使得产品失水较快。

2.3 总糖含量的变化

图 3 荔波传统酸肉发酵过程中总糖含量的变化Fig.3 The change of total sugar in Libo sour meat during fermentation period

由图3可知，发酵过程中，总糖的含量总体呈下降趋势，在发酵前40d下降迅速，由1.11%下降到0.63%，以后持续缓慢下降，趋于稳定。说明总糖发生了分解，产生的酸增加。

2.4 蛋白质含量的变化

图 4 荔波传统酸肉发酵过程中蛋白质含量的变化Fig.4 The change of protein content in Libo sour meat during fermentation period

由图4可知，在传统酸肉的发酵过程中蛋白质一直呈上升的趋势，新鲜猪肉(即0d时)的蛋白质含量是最低的，随着发酵时间的延长，微生物的增殖以及水分的减少，蛋白质含量相应增加，从初始的13.02%一直增加到60d时的18%左右。总氮变化与蛋白质的降解和微生物代谢产生的一些含氮化合物有关[4]。

2.5 脂肪含量的变化

图 5 荔波传统酸肉发酵过程中脂肪含量的变化Fig.5 The change of fat content in Libo sour meat during fermentation period

在传统酸肉的发酵过程中脂肪一直呈上升的趋势，到发酵完成后脂肪含量可达31.20%(图5)，可能主要是因为微生物生长代谢更新[19]，大量积累微生物菌体，而微生物细胞壁的磷脂层使得脂肪含量上升；脂肪含量的增加也与水分的减少有关。总脂肪变化是由脂肪的氧化和降解产生的一些脂类化合物引起的[5]。

2.6 总酸含量的变化

由图6可知，2个处理中传统酸肉在自然发酵10d内总酸含量降低，此后随pH值的降低而上升，说明pH值在一定程度上反映总酸含量的高低。但两者并非一一对应，有时pH值增大而总酸含量增加，因为pH值仅表示酸肉中游离氢离子(H+)的多少，而总酸为各种酸性物质的总和，包括乳酸和其他酸性物质。

图 6 荔波传统酸肉发酵过程中总酸含量的变化Fig.6 The change of total acid content in Libo sour meat during fermentation period

2.7 氨基酸态氮含量的变化

图 7 荔波传统酸肉发酵过程中氨基酸态氮含量的变化Fig.7 The change of amino nitrogen in Libo sour meat during fermentation period

由图7可知，2个处理中传统酸肉在自然发酵40d内氨基态氮含量呈缓慢上升趋势(20mg/100g上升到第45天的50mg/100g以上)，然而在发酵的40～60d内以较快速度上升到132.45mg/100g。蛋白质在发酵微环境及肌肉蛋白酶的共同作用下降解产生游离氨基酸和多肽，另外，与部分氨基酸脱羧、脱氨或进一步代谢生成醛、酮及其他小分子化合物也有一定关系，这些肉蛋白的降解产物能促进风味形成，同时也是进一步产生风味物质的底物，发酵后酸肉氨基酸态氮含量增加显著，表明发酵能提高肉制品的营养价值与风味。

2.8 挥发性盐基氮含量的变化

图 8 荔波传统酸肉发酵过程中挥发性盐基氮含量的变化Fig.8 The change of volatile salt-basic nitrogen in Libo sour meat during fermentation period

在酸肉发酵过程中，由于蛋白质和脂肪的变化，赋予肉独特的风味，同时也会造成肉的腐败变质。在肉的腐败过程中，蛋白质分解而产生的氮以及胺类等碱性含氮物质即挥发性盐基氮。2个处理中传统酸肉在自然发酵的前30d，挥发性盐基氮含量变化缓慢，从第45天开始，挥发性盐基氮含量上升趋势明显，在第60天时的含量达到80.86mg/100g(图8)。

2.9 游离氨基酸的分析

在传统酸肉1发酵过程中，分别测定了原料肉和发酵60d酸肉的氨基酸，通过对比分析结果发现，氨基酸总量增加(表1)，7种必需氨基酸总含量由发酵前的8.02g/100g，增加到发酵后的21.96g/100g，在一定程度上提高了产品的营养价值。与发酵前相比，大部分氨基酸含量都提高了，其中谷氨酸含量增加最多，其次是甘氨酸、蛋氨酸和赖氨酸等，表明肉类经过发酵后的营养价值更高。

表 1 发酵前后传统酸肉的氨基酸组成和含量Table 1 The compositions and contents of amino acids in traditional sour meat before and after fermentation

2.10 风味物质的变化

采用气相色谱和质谱联用的方法，对荔波传统酸肉的风味物质进行分析比较，以下是传统酸肉发酵后挥发性风昧物质总离子流色谱图(图9)，分析结果列于表2中。

图 9 传统酸肉挥发性风味化合物GC-MS总离子图Fig.9 Total ion current chromatogram of volatile compounds from traditional sour meat

根据总离子流图可明显分离出34种主要化合物。其中酸类15种、醛类11种、烷烃类1种、烯类1种、酯类3种、醇类3种，其中酸类最多，占总组分的44%，说明传统酸肉主要以酸味物质为主。

表 2 传统酸肉主要挥发性化合物组成与分子特性Table 2 Volatile compounds and relative contents in traditional sour meat

2.11 有害成分分析

表 3 有害成分检测结果Table 3 The results of microbiological hygiene index

腐生菌能产生大量的吲哚、硫化氢、胺和酚等代谢产物，这些产物在肝脏中通过酸解毒，随尿以葡糖醛酸盐和硫酸盐等形式排出，如果不能及时解毒，将导致肝功能紊乱和循环系统异常，干扰神经系统并影响睡眠[20]。由表3可知，在传统酸肉中H2S、吲哚均未检出。发酵肉制品中都含有一定量的亚硝酸盐，大量食用亚硝酸盐后会导致人中毒，传统酸肉中的亚硝酸盐含量达到0.009g/100g，超出了国标要求，存在一定的安全隐患。

3 结 论

贵州荔波传统酸肉在发酵期间理化成分中的大分子物质含量变化趋势不同，总糖含量减少，与酸含量的显著增加呈正相关，发酵成熟时pH值在3.60左右，蛋白质和脂肪含量的增加与发酵期间微生物的繁殖和水分的减少有关，发酵产物总酸、氨基酸态氮、游离氨基酸与挥发性盐基氮的含量都呈逐渐上升趋势，表明大分子物质在逐步降解，酸肉的最终水分含量在40%左右；酸肉中的风味物质包含多种成分，主要有酸类、醛类、酯类、醇类等；有害成分分析发现，传统酸肉中吲哚、硫化氢均未检出，亚硝酸盐含量(0.009g/100g)高于国家标准，因而传统酸肉存在一定的安全隐患。

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