响应面法优化枸杞叶粗多糖提取纯化工艺及其降血糖活性

江 磊，梅丽娟，刘增根，李洁琼，王启兰，邵 赟，陶燕铎,*

(1.中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2.中国科学院大学，北京 100049)

糖尿病是一种临床表现为高血糖的系统性疾病，它的直接引发原因是胰岛素分泌不足，这种病会引起体内糖类、蛋白质和脂类代谢紊乱[1]。在糖尿病患者中，90%的病人都属于Ⅱ型糖尿病。患这种糖尿病的病人群体数量有扩张趋势，这种病给家庭和社会带来了沉重的经济负担[2]。持续性高血糖可以引起体内非酶反应的蛋白糖基化，从而在临床上表现为糖尿病的复杂病理特征[3]。控制餐后血糖就变成了治疗糖尿病过程中的一个重点[4]。在哺乳动物体内，淀粉的消化主要在小肠内，首先由α-淀粉酶将长链淀粉分子消化为直链或支链的低聚麦芽糖，然后由α-糖苷酶将这些低聚糖消化为葡萄糖[5]。因而抑制α-糖苷酶活性就成了控制餐后血糖的关键[6]。

枸杞叶俗称天精草，《本草纲目》中称枸杞叶“有除烦益志补五劳七伤、壮心气、除热毒、散疮肿、除风明目”之功效。据研究，枸杞叶的活性成分与枸杞果实基本一致，而且在某些营养元素上甚至超过枸杞果实[7]。据报道枸杞多糖具有减轻Ⅱ型糖尿病小鼠胰岛素抵抗[8]，诱导树突状细胞成熟和增强T细胞增殖[9]，增强人外周血巨噬细胞的免疫功能[10]，治疗胃溃疡[11]，保护血管内皮细胞[12]和抑制人食管癌细胞Eca-109的生长增殖[13]等生理功效。枸杞叶多糖可能和枸杞多糖一样具有这些功效。为了研究枸杞叶多糖的药用价值，其提取纯化方法变得至关重要。本实验采用响应面法对枸杞粗多糖的提取工艺进行优化，利用大孔树脂和DEAE弱阴离子交换柱对枸杞叶粗多糖进行了纯化，用α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的方法测定了枸杞叶精多糖对α-糖苷酶的抑制活性，从而估计枸杞叶精多糖的降血糖活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

取25℃条件下阴干的枸杞叶，于60～80℃烘干2h，经粉碎、干燥至质量恒定后备用。

p-NPG、α-糖苷酶(E.C.3.2.1.20) 美国Sigma 公司。DEAE-52阴离子交换柱柱料 美国Amresco公司；D101大孔树脂 天津南大树脂科技有限公司。苯酚、浓硫酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1800型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；HH-6恒温水浴锅 郑州杜甫仪器厂；AE240S型电子分析天平 德国梅特勒-托利多公司；Model 680酶标仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 多糖含量的测定

准确称取100mg葡萄糖，以去离子水溶解并定容至100mL，精确量取葡萄糖标准工作液(1mg/mL)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于试管中，各加去离子水使成2mL，各管中葡萄糖的质量浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL。吸取上述各管中的葡萄糖溶液0.6mL至于干净试管中，加6%苯酚试剂1.2mL摇匀。迅速滴加浓硫酸6.0mL，并迅速摇匀。静置5min，沸水浴15min取出。流动水冷却至室温。另以0.6mL去离子水同样操作，作空白对照，在490nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度C为横坐标、吸光度A为纵坐标，制作标准曲线并得其回归方程为A＝9.75C－1.09(R2＝0.9995)。

多糖含量的测定参考方崇波等[14]的方法稍作修改。精密称取一定质量的枸杞叶粗多糖样品，测定吸光度后计算葡萄糖质量浓度后，按照下式计算枸杞叶粗多糖样品中多糖的含量：

式中：C1为葡萄糖的质量浓度；V是样品溶液总体积；m为样品总质量；D为样品稀释倍数。

1.4 基本提取工艺流程

枸杞叶粗多糖制备的基本工艺流程：阴干的枸杞叶经粉碎后过100目筛→热水浸渍提取→离心取上清液(4000r/min，10min)→乙醇沉淀→离心取沉淀(4000r/min，10min)→乙醇洗涤→干燥溶剂→枸杞叶粗多糖。

1.5 单因素试验

设定温度70℃、浸提时间2h、料液比(枸杞叶粗粉与水质量比)1：50，固定其他条件分别考察料液比(1：30、1：40、1：50、1：60)、浸提温度(60、70、80、90℃)、浸提时间(l、2、3、4h)对枸杞叶粗多糖得率的影响。

1.6 响应面法对工艺进行优化

利用响应面法，对水解条件进行优化。以多糖含量作为响应值，试验因素及水平见表1。

表 1 水解工艺的试验因素编码表Table 1 Independent variables and their coded levels used in response surface analysis

1.7 枸杞叶粗多糖的纯化

首先将枸杞叶阴干粉碎，于90℃纯水中浸渍5h，离心取上清液并加入无水乙醇使最终醇体积分数达到85%后于常温沉淀2h。将沉淀用无水乙醇洗涤2次，干燥后得到枸杞叶粗多糖。最后将枸杞叶粗多糖于4℃保存待用。

将上述干燥的枸杞叶粗多糖小心溶于去离子水中，并将此多糖溶液通过已处理的D101大孔树脂柱，流速10mL/min。再用去离子水以相同的流速用3倍柱体积的流量进行洗柱。小极性杂质均吸附在大孔树脂上，去离子水洗脱下的组分即为第一步纯化后的枸杞叶多糖溶液。将此多糖溶液冷冻干燥后于4℃保存待用。

将第1步纯化中多糖冻干粉用去离子水溶解，溶解时应注意要尽可能的增加溶液的浓度。将多糖溶液通过已用去离子水平衡的DEAE-52柱分离，流速 0.15mL/min。在进行洗脱时流速为1mL/min，首先用3倍柱体积的去离子水洗柱，除去不能吸附的杂质，然后用1.0mol/L的NaCl溶液进行洗脱。将洗脱液透析除盐后冷冻干燥即为纯化后的枸杞叶精多糖(PO)，于4℃保存待用。

1.8 PO的α-糖苷酶抑制活性测定

1.8.1 样品溶液的制备

首先配制2mg/mL的PO溶液，用去离子水稀释成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1mg/mL。阳性对照药阿卡波糖配成1.0mg/mL。

1.8.2 α-糖苷酶抑制活力的测定

参考康文艺等[15]的方法稍作修改。将5U的α-糖苷酶溶于50mmol/L的pH7.4的磷酸缓冲液中定容至1mL制成酶液。将待测样品精确称取10mg定溶于1mL相同的磷酸缓冲液中制成样品溶液。取1mL相同的磷酸缓冲液用作空白对照。首先在96孔板中加入酶液20μL和样品液40μL，37℃水浴10min。然后用排枪快速加入60μL的20mmol/L的P-NPG溶液，37℃水浴10min。反应结束后，立即用排枪快速加入0.2mol/L Na2CO3(160μL/孔)。将96孔板置于酶标仪上用405nm波长进行检测，α-糖苷酶活性抑制率计算公式如下：

式中：A0为空白的吸光度；A1为样品吸光度。

1.9 统计与分析

本实验采用SAS 9.1软件对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对多糖含量的影响

图 1 料液比对枸杞叶多糖含量的影响Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on polysaccharides content of crude extracts

由图l可知，料液比在1：30～1：40范围内，枸杞叶粗多糖含量迅速上升，从6.57%上升到6.82%，增加了2.50%。但是在1：40～1：60范围内，枸杞叶粗多糖含量上升缓慢，增加了0.09%。从实际生产成本综合考虑，选取1：30、1：40和1：50三个水平进行响应面试验。

2.1.2 提取温度对多糖含量的影响

图 2 提取温度对多糖含量的影响Fig.2 Effect of temperature on polysaccharides content of crude extracts

提取温度为60℃时，多糖含量为6.64%；提取温度为80℃时，多糖含量迅速上升到6.71%；当提取温度从80℃上升到90℃时，多糖含量增加缓慢，提高了0.08%，因此选择提取温度水平60、70℃和80℃进行响应面试验。

2.1.3 提取时间对多糖含量的影响

提取时间为1h时，多糖含量较低，为6.47%；当浸提时间为2h时，多糖含量有较大幅度的提高，为6.63%。提取时间为3h和4h时，多糖含量分别为6.85%和6.91%。但3h后上升缓慢，因此选择1、2h和3h进行响应面试验。

图 3 提取时间对粗多糖含量的影响Fig.3 Effect of time on polysaccharides content of crude extracts

2.2 响应面试验

表 2 响应面设计及响应值Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

应用SAS 9.1统计软件对响应面试验结果(表2)进行多元二次回归分析，将极不显著的项(X3)剔除之后，可以得到回归方程：

表 3 回归分析表Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression model

如表3所示，对回归方程的各因子和总体进行方差分析，结果表明各应变量与全体自变量多元回归关系显著，因此可以用回归值代替真实值对实验进行研究。

图 4 各因素交互作用对多糖含量的响应面图Fig.4 Response surface plots for the effect of extraction parameters on polysaccharides content of crude extracts

如图4A所示，在一定范围内，多糖含量随料液比和提取温度的升高而升高，显出极显著的交互作用关系，图4B和4C同样可以观察到。随着温度的升高，多糖分子内能增加，分子运动加剧，溶解性增强；而温度过高会破坏多糖分子，促进杂质溶入，造成最后样品中多糖含量偏低。因此温度只能控制在一个合适的范围内。如果料液比太大，溶剂溶解多糖的能力有限，会造成多糖含量低；而料液比太小又会使许多杂质成分溶入提取液中，也会造成多糖含量低。因此料液比也只能控制在一个合适的范围内。提取时间过长，会促进杂质成分的溶入，而提取时间太短会降低多糖分子溶解量，因此提取时间也只能控制在一个合适的范围内。

根据图4观察最佳水解条件近似为：料液比1：50、温度70℃、时间2h。为了得到准确的工艺条件，将多元二次方程两边分别对X1、X2、X3做一阶偏微分，对方程组的一阶偏导取值为零，得到方程组：

解得最优条件为X1＝0.1458、X2＝0.1298、X3＝0.1194，即：料液比1：47.2、温度72.9℃、时间2.2h。

2.3 对最优提取工艺的验证实验

利用2.2节中得到的最佳提取工艺参数，料液比1：47.2、温度72.9℃、时间2.2h，平行进行5次实际提取实验，得到的多糖含量为(7.24±0.41)%，与模型值7.36%相近，再次验证了回归模型的正确性。

2.4 α-糖苷酶抑制活性的测定

经苯酚硫酸法检验，纯化后多糖含量为92.5%(后文中的枸杞叶多糖指的是提纯后的枸杞叶多糖)。将纯化后的多糖用于α-糖苷酶活性的检测，结果如图5所示，枸杞叶多糖在质量浓度范围0.3～0.7mg/mL范围内对α-糖苷酶的抑制活力表现出强烈的质量浓度依赖性，在质量浓度大于0.8mg/mL时进入平台期，抑制活力随抑制剂质量浓度增大变化不大。这表明PO具有抑制糖吸收的功能，具有降糖的功效。由表4可知，在相同质量浓度1mg/mL下，枸杞叶多糖的抑制率达93.7%，而阿卡波糖(Acarbose)仅为21.7%。枸杞叶多糖对α-糖苷酶半数抑制率IC50＝0.51mg/mL。

图 5 PO的抑制率随质量浓度变化的关系Fig.5 Relationship of α-glycosidase inhibitory activity and concentration of purifi ed polysaccharides

表 4 空白、阳性药物、PO对α-糖苷酶的抑制率比较Table 4 Comparison of α-glycosidase inhibitory activity of acarbose and purifi ed polysaccharides

3 结 论

采用热水浸提法提取枸杞叶粗多糖，其工艺参数用响应面法进行优化，得到的回归方程的R2＝0.9942，说明拟合方程可以很好地描述实际值。优化的工艺参数结果为：料液比1：47.2、温度72.9℃、时间2.2h，此条件下多糖含量为(7.24±0.41)%，工艺验证实验表明最大工艺条件可靠。采用大孔树脂和DEAE阴离子交换树脂对枸杞叶多糖进行纯化，纯化后含量升至92.5%。用纯化后的多糖进行α-糖苷酶抑制剂活性检测，结果表明枸杞叶精多糖是一种很好的α-糖苷酶抑制剂，其IC50＝0.51mg/mL。

[1] STEPHENS J, BOTTEMAN M, HAY J. Economic impact of antidiabetic medications and glycemic control on managed care organizations： a review of the literature[J]. Journal of Managed Care Pharmacy, 2006, 12(2)： 130-142.

[2] YACH D, STUCKLER D, BROWNELL K. Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes[J]. Nature Medicine, 2006, 12(2)： 62-66.

[3] LEBOIVTZ H E. Postprandial hyperglycemic state： importance and consequences[J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 1998, 40(Suppl1)： S27-S28.

[4] BARON A. Postprandial hyperglycemia and alpha-glucosidase inhibitors[J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 1998, 40(Suppl1)： 51-55.

[5] CASIROLA D M, FERRARIS R P. Alpha-glucosidase inhibitors prevent diet induced increases in intestinal sugar transport in diabetic mice[J]. Metabolism, 2006, 55(6)： 832-841.

[6] NAKAMURA K, YAMAGISHI S, MATSUI T, et al. Acarbose, an alphaglucosidase inhibitor, improves insulin resistance in fructose-fed rats[J]. Drugs under Experimental and Clinical Research, 2005, 31(4)： 155-159.

[7] 贺晓惠, 贾孟辉, 俞维, 等. 宁夏枸杞叶基础研究述要及应用开发的前景[J]. 时珍国医国药, 2007, 5(1)： 1111-1112.

[8] 宗灿华, 田丽梅. 枸杞多糖对2型糖尿病胰岛素抵抗模型大鼠resistin基因表达的影响[J]. 药物生物技术, 2008, 15(4)： 275-277.

[9] 张纯清, 单铁英, 杨书良, 等. 枸杞多糖对诱导树突状细胞成熟和增强T细胞增殖的影响[J]. 重庆医学, 2010, 39(16)： 2117-2118.

[10] 许忠新, 单铁英, 苏安英, 等. 枸杞多糖对人外周血巨噬细胞活性的影响[J]. 重庆医学, 2010, 39(16)： 2177-2178.

[11] 张一芳, 冯怡, 徐德生. 枸杞多糖对大鼠实验性胃溃疡的作用研究[J]. 中国药业, 2011, 20(1)： 14-15.

[12] 李鹏, 尹雅玲, 卢光洲, 等. 枸杞多糖抑制对硫磷致血管内皮功能损伤的研究[J]. 天津医药, 2011, 39(1)： 56-58.

[13] 单铁英, 孙健, 王芳, 等. 枸杞多糖诱导人食管癌细胞Eca-109凋亡的实验研究[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(7)： 1642-1643.

[14] 方崇波, 赵夏雨, 吴巧凤. 苯酚硫酸法测定猕猴桃多糖注射剂中多糖的含量[J]. 海峡药学, 2010, 22(10)： 64-66.

[15] 康文艺, 张丽, 陈林, 等. 两种唇形科植物荔枝草和夏至草α-糖苷酶抑制活性研究[J]. 中成药, 2010, 32(3)： 493-495.