近红外光谱技术在酶法转化制备L-鸟氨酸过程中的应用

郭婷婷，肖 雪，丁国钰，彭佳敏，* ，高智慧，白 钢

(1.南开大学药学院，天津市分子药学重点实验室，天津300071;2.天津市启仁医药科技有限公司，天津300457)

L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质组成氨基酸，以游离的形式存在于组织和细胞中，具有重要的生理活性和功能［1］。L-鸟氨酸兼具有营养和治疗功能，在医疗保健［2-3］、化工［4］等领域有着广泛的应用。目前L-鸟氨酸主要有化学合成法［5］、水解精氨酸法［6］、微生物发酵法［7］等，由于化学合成法得到的是消旋体，分离较难，故现阶段的研究主要集中在水解精氨酸法和微生物发酵法，因此对酶促反应液及发酵液中L-鸟氨酸的含量测定有着相当重要的意义。建立一种简单、快速而又有效的检测方法对于L-鸟氨酸的制备非常必要。目前，L-鸟氨酸的测定以采用HPLC 衍生化法［7］、氨基酸自动分析仪法［8］、气相色谱［9］、离子交换色谱［10］、酶法分析［11］和比色法［12］为多，而HPLC 衍生化法和气相色谱法操作复杂，氨基酸自动分析仪法费用昂贵，比色法操作较为麻烦，耗时较长。 近红外光谱技术 (Near Infrared Spectroscopy，NIRS)是近年来迅速发展起来的一种高新分析技术，具有简便、快速、低成本、无污染、对样品无破坏性以及可实现多组分同时测定等优点，是最适于实现在线分析和实时控制的成熟技术之一，被广泛应用于酿酒［13］、制药［14］、化工［15］、食品［16］等行业的质量监测、控制和相关研究。NIRS 在发酵过程检测领域的研究已有文献报道，早在1990 年，Cavinato 等人［17］采用光电二极管阵列光谱结合光纤探头产生短波NIR 光谱监测玻璃壁的发酵罐中乙醇含量;刘国海等［18］利用NIRS 结合ELM 快速检测秸秆蛋白饲料固态发酵过程参数值pH。在氨基酸生产方面，Arnold 等人［19］成功的将NIR 技术应用于CHO 细胞分批发酵过程中谷氨酰胺、氨基酸、乳酸和葡萄糖的含量测定，但其他相关报道较少。本文通过NIRS 分析法能够快速测定绝大多数种类的化合物及其混合物，对酶法制备过程进行迅速监测，从而准确快速确定L-鸟氨酸酶法制备的终点。利用NIRS 对酶促反应主产物L-鸟氨酸进行测定，结合偏最小二乘法对其建立了定量模型，并进行了初步的含量预测，为L-鸟氨酸酶法制备的在线控制提供了一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

精氨酸酶 天津启仁医药科技有限公司(批号为20110919);L-精氨酸(纯度＞99.0%) 阿法埃莎(天津)化学有限公司;茚三酮、冰乙酸、磷酸等 分析纯，天津光复化学试剂研究所。

UV-1800 型紫外分光光度计 日本SHIMADZU公司;KQ3200 型超声波清洗仪 昆山超声仪器有限公司;HB-202 型恒温金属浴 上海民仪电子有限公司;Tensor 37 型近红外光谱仪 德国Bruker 公司;Milli-Q 纯化水系统 美国Millipore 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 L-鸟氨酸含量测定 L-鸟氨酸酶活测定及含量测定均采用茚三酮比色法［12］。

1.2.2 L-鸟氨酸酶法制备 利用精氨酸酶将L-精氨酸转化为L-鸟氨酸，响应面设计确定酶促反应的最佳条件为:L-精氨酸150g/L，精氨酸酶0.5g/L，pH10，反应温度37℃。在最佳条件下进行反应，收集0～12h 反应样品;将反应体系扩大10 倍，在最佳条件下进行反应并收集样品。

1.2.3 近红外光谱扫描 采集不同时间样品的透射光谱图，光谱扫描范围4000～12000cm-1，扫描次数32次，分辨率为8cm-1，每个样品重复扫描3 次，液体样品池为2mm 光程的石英比色皿，实验采用空气为参比进行光谱扫描，测量时温度为25℃，湿度为50%。

1.2.4 数据处理 采用了多种预处理方法如无光谱预处理(No spectral data preprocessing)、一阶导数(Frist Derivation)、二阶导数(Second Derivation)、矢量归一化(Vector normalization，SNV)、多元散射校正(Multiplicative scattering correction，MSC )、Frist Derivation + SNV 和Frist Derivation + MSC 等对光谱进行处理，并建立模型。建模样品按照校正集∶预测集=4∶1 的比例划分校正集与预测集，其中校正集的浓度范围大于预测集。

采集的光谱数据，均运用OPUS 7.0 数据分析软件，进行数据处理和计算。

2 结果与分析

2.1 L-鸟氨酸样品的制备

2.1.1 精氨酸酶活力测定 通过酶活力测定最终得到L-鸟氨酸的标准曲线为A =3.305c-0.0274，R2=0.9978，其中A 为吸光度，c 为L-鸟氨酸的浓度。精氨酸酶活力为6317U/g。

2.1.2 L-鸟氨酸样品的制备 收集不同时间反应样品，采用茚三酮比色法测定L-鸟氨酸，并计算酶促反应转化率，结果见图1。

图1 酶促反应转化率随时间变化趋势图Fig.1 The curve of enzymatic reaction conversion versus time

2.2 模型的建立与选择

2.2.1 近红外光谱采集及波长区间选择 采集样品的透射光谱，原始光谱见图2。共收集97 份样品，其中77 份用于建模，20 份用于外部检验。由图2 可见，在5500～4000cm-1，仪器噪音较大，不适合建立模型，故选择10000.0～5500.0cm-1波段建立模型。

图2 样本原始光谱图Fig.2 The original near infrared transmitted spectra of the samples

2.2.2 预处理方法选择 表1 为分别采用无光谱预处理、一阶导数光谱、二阶导数光谱、矢量归一化光谱、多元散射校正、一阶导数+矢量归一化和一阶导数+多元散射校正等方法对光谱进行预处理后所建立模型的预测均方差(RMSEP)、校正均方差(RMSEE)和决定系数(R2)。由表1 可知，采用一阶导数对光谱预处理时RMSEP 最小，R2值最大，RMSEE 较小，R2较大，效果最好。不同预处理方法得到的光谱图如图3 所示。

2.2.3 主因子数选择 用偏最小二乘法建立校正模型，主成分数的选择对模型的预测能力影响较大。主成分数太多，使模型包含过多的测量噪音;主成分数过少，导致建模信息不全，预测能力差［20］。本研究采用检验集检验法，根据RMSEP 与RMSEE 随主因子数变化图(图4)，选择主因子数为4。

2.2.4 模型建立 综上所述，本实验在10000.0 ～5500.0cm-1波段范围内建立数学模型，最终选择一阶

图3 不同预处理优化后图谱Fig.3 The spectra after the optimization of the different pretreatment

图4 检验集检验均方差与主因子数相关图Fig.4 Relationship of the rank and the RMSEP ＆ RMSEE of the test set validation

图5 校正集样品(A)与检验集样品(B)的预测值与测定值的相关图Fig.5 Correlation of NIR predicted and measured values for calibration set(A)and validation set(B)

2.3 模型的验证及应用

2.3.1 模型外部验证 利用建立的定量模型，预测验证集的20 个样品，结果见图6。由图可见，20 个样品近红外光谱预测值与测定值的相关性良好，外部验证模型相关系数R2为0.9827，说明模型的预测效果较好。

2.3.2 模型的应用 将建立的模型用于放大反应体系后样品的测定。由于反应体系发生变化，需要对模型进行校正。校正后模型参数如表3 所示。校正后模型与原模型相比较，模型的相关系数与均方差均略微降低，但仍可满足测定要求。利用校正后的模型，预测放大反应体系后的28 个样品，结果见图7。由图可见，28 个样品近红外光谱预测值与测定值的相关性良好，模型预测相关系数R2为0.9874，说明模型的预测效果较好。

3 结论

L-鸟氨酸是一种多功能的氨基酸，应用越来越广泛，有很强的开发价值，同时具有巨大的市场空间。与常规实验方法相比，NIRS 样品无需前处理，准确性较高、费用低、耗时短、适用于生产过程在线监测分析。本文利用NIRS 建立了L-鸟氨酸含量定量模型并验证了模型能力，并将NIRS 应用于模拟监测L-鸟氨酸酶法制备过程中含量动态变化，结果证明:模型预测效果较好，可以用于L-鸟氨酸酶法制备实时监测，同时也为L-鸟氨酸及其他氨基酸生产过程中的检测提供一种新的研究思路。

表1 光谱预处理方法对分析模型的影响Table 1 Effect of different pretreatments on analysis model

表2 模型参数Table 2 Parameters of the model

表3 校正后模型参数Table 3 Parameters of the model after calibration

图6 模型预测集相关图Fig.6 Correlation of prediction values and measured values on the model

图7 校正后模型验证相关图Fig.7 Correlation of prediction values and measured values on the model after calibration

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