中国荷斯坦牛IL8基因SNP－233（G＞A）不同基因型的表达差异研究

陈仁金，王珍珍，杨章平，毛永江，冀德君，朱孝荣

（1.徐州医学院实验动物中心，江苏 徐州 212004；2.徐州医学院神经生物学研究中心，江苏 徐州 212004；3.扬州大学动科学院，江苏 扬州 22500）

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一，在世界范围内造成了巨大的经济损失，研究者尝试许多方法用于控制这种复杂的疾病，包括改进牧场的管理、对干奶牛进行抗生素治疗、注射疫苗和监控临床乳房炎等。随着分子生物技术的发展，用生物技术手段来预防和控制乳房炎成为热点之一。

IL－8自发现以来，成为在趋化性细胞因子中是一个比较活跃的研究领域，各种非特异性炎症的病理发生过程中频繁地有IL－8的参与，以及IL8基因易于受到外界的刺激而被激活，因此IL－8可能在炎症、免疫反应和机体防御反应中具有广泛的作用。对于IL－8在人类上研究较多［1－3］，而与奶牛疾病方面的研究最近几年越来越受关注。IL－8易于受到外界的刺激而被激活，已研究证明IL－8蛋白和mRNA的表达与奶牛乳房炎有密切的联系［4］。当牛乳房受感染后，IL－8能诱导宿主防御系统抵抗病菌的侵入，同时IL－8会大量聚集。IL8基因的表达量也显著增加［5－7］。研究发现IL8基因－233（G＞A）和2789（A＞G）＆2862（T＞C）位点对SCS显著相关；了探索该位点不同基因型个体在血液中的表达差异，对该位点形成的不同基因型个体荧光定量PCR分析。对IL8基因的抗病机理进行初步探索，为奶牛抗乳房炎性状候选基因的研究积累基础分子数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取扬大牧场健康的中国荷斯坦牛30头。胎次在2～3胎，处于泌乳中期。保证IL8基因各个基因型10头。尾静脉采血，ACD抗凝剂，新鲜血样提取RNA，提取的RNA－70℃保存。

1.2 引物设计

根据用于荧光定量的目的基因IL8基因的mRNA序列（GenBank：NM＿173925）设计引物，内参基因β－actin引物根据 mRNA序列（GenBank：AY141970）设计。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物见表1。

表1 荧光定量PCR引物

1.3 RT－PCR

反应过程参照TaKaRa RNA AL PCRTMKit（AMV）反转录试剂盒使用说明，按步骤进行。将血液中总RNA作为模板在灭菌的0.2mL PCR离心管中依次加入以下组分的样品。反转录体系为20 μL（反应液在冰上配制）：在0.2mL的PCR管中加入1μg的总RNA，Oligo dT Primer 1μL，5×PrimeScriptTMBuffer 4μL，Random primers 1μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1μL，加 RNase Free dH2O至总体积为20μL。将加好试剂的PCR管瞬时离心后放在PCR仪上进行反应。反转录条件如下：37℃15min（反转录反应）85℃5sec（反转录酶的失活反应）所得产物即为cDNA，－20℃保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR

采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量，荧光定量PCR体系为20μL：

以上步骤均为冰上操作，每个样本设三个重复。

荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性1min；95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸34s（data collection），40个循环；为分析扩增产物的特异性，PCR扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析，程序为：95℃ 15s，60 ℃ 1min；95 ℃ 15s，60℃15s。

1.5 统计软件与方法

Primer Premier 5.0，SPSS11.0统计分析软件荧光定量计算采用2－△△CT方法［8］。

2 结果与分析

2.1 RNA的提取

RNA提取结果见图1总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检出3条亮带，从上到下分别为28s，18s和5s，说明提取的RNA完整性良好，无明显降解，其OD260／OD280在1.8左右，纯度较高，可用于后续的实验。

2 结果与分析

2.2 IL8基因突变位点3种基因的相对定量表达分析

IL8基因－233（G＞A）位点的突变产生3种基因型。AA、AG和GG 3种基因型在血液中的荧光定量的△CT见表2，GG基因型的△CT极显著低于AA和AG基因型（P＜0.01）。GG基因型的相对表达量极显著高于AA和AG基因型（P＜0.05）（图2）。

图2 IL8基因－233（G＞A）位点不同基因型的表达量

表2 IL8基因－233（G＞A）位点不同基因型个体的△CT和RQ值

3 讨论

IL8是一种重要的趋化因子，具有刺激中性粒细胞、淋巴细胞发生趋化游走，介导细胞在炎症部位聚集、活化以及修复损伤的组织等功能［9］。然而，这些作用必须通过其与相应受体（interleukin－8receptor，IL8R，即CXCR）结合并借助信号转导来实现［10］。在大肠杆菌感染引起的乳房炎的奶中，IL－8含量显著增加［11，12］。在金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳房炎泌乳物中，能检测到IL－8趋化活性，但在非乳房炎泌乳物中没有此活性［13］。所以在乳房炎发生时，IL－8诱导激发中性粒细胞时起着重要的作用。

对于IL8基因的－233（G＞A）位点，GG基因型的表达量显著高于其它两种基因型（P＜0.05），所以GG基因型有较强的乳房炎抗性。233（G＞A）位点位于IL8基因的5′侧翼区，该突变可能影响该基因表达调控，结果显示，突变使该基因的表达量下降。对于其机理，需要进一步进行分析研究。

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