胚龄、激素对小麦单倍体萌发率及成苗率的影响

孙苏阳， 王永军， 李海军， 李丽丽， 蒋学祥

(江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，中国农业科学院矮败小麦育种技术创新中心＜淮安＞，江苏 淮安 223001)

常规的小麦品种选育，一般需要5～8年才能形成农艺性状相对整齐一致的稳定群体。如果进行远缘杂交，由于杂种后代疯狂分离，则品种纯化需要更长的时间。小麦单倍体育种是将单倍体染色体加倍获得纯合双单倍体。通常双单倍体在一个世代中就可以得到纯合的重组体，这对于缩短小麦品种育种年限，提高育种效率很有意义。

自1964年人们经过花药离体培养获得单倍体后，应用单倍体技术进行品种改良迅速发展。但对于普通小麦而言，这种产生单倍体的方法，不仅成苗率低，而且会产生大量的白化苗。1975年Barely［1］用普通小麦与球茎大麦杂交获得了高频率的小麦单倍体，但后来的研究表明普通小麦与球茎大麦之间的杂交存在不亲和性，并已证明这种不亲和性是由于位于小麦5B染色体长臂上的Kr1基因和5A染色体长臂上的Kr2基因有阻止小麦与异源植物交配的功能，从而限制了该法在小麦育种上的应用。1984年德国学者Zenkteler［2］最早报道了玉米花粉诱导小麦获得球形胚的研究结果，但无细胞学证明。1986年Laurie等［3］进行了详细的细胞学观察，证明了小麦与玉米杂交后，在最初的3次细胞分裂中，来自父本玉米的染色体被完全排除掉，形成了仅有21条母本小麦染色体的单倍体胚。进一步研究表明，小麦×玉米的受精频率不受小麦所携带的Kr1、Kr2基因的影响，说明Kr基因在小麦与玉米杂交中是不敏感的［4］。1988年，Laurie等［5］利用小穗培养法获得了小麦×玉米产生的单倍体植株。因此利用小麦×玉米诱导单倍体是一种有效的单倍体育种方法。

适宜的胚龄对幼胚的培养十分重要，而不同的学者对此研究结果不尽相同［6-8］，胚龄从11～16 d不等。吕国锋等［6］在用1/2MS培养基培养幼胚时不添加任何激素，而蔡黎明［9］研究认为在1/2MS培养基中添加0.2 mg/L IAA及0.2 mg/L 6-BAP的培养效果较不添加激素的效果好。本试验拟通过研究不同胚龄以及1/2MS培养基中激素的有无对幼胚萌发率和成苗率的影响，以期确定本地区适宜幼胚离体培养的最佳胚龄及培养基，使这种单倍体育种方法最大程度地发挥其作用。

1 材料与方法

1.1 材料

父本玉米花粉供体为江南花糯和蜜玉1号两个杂交种的混合花粉。母本为(西农979×淮麦18)F1、(西农979×淮麦24)F1、(小偃6号×淮麦19)F1、(小偃6号×淮麦24)F1和太谷核不育小麦的6种不育株后代。小麦于2011年10月10日播种，玉米在塑料大棚内分5期播种，分别为2011年12月4日、12月24日，2012年1月14日、2月8日和2月21日，以调节小麦和玉米的花期。胚龄以玉米第1次授粉到剥取颖果的天数计。试验在江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所试验基地实施。

1.2 小麦与玉米杂交

小麦抽穗后对常规杂交种进行剪颖、去雄、套袋，对太谷核不育的不育株剪颖套袋。小麦开花时采集新鲜的玉米花粉给小麦逐花授粉，第1次授粉后24 h进行第2次重复授粉。2，4-D的处理参照姚景侠［10］的方法，第1次授粉24 h后向小麦柱头上用微量喷雾器喷洒100 mg/kg的2，4-D溶液1.5 ml，48 h 后再次用 100 mg/kg的 2，4-D 溶液 1.5 ml处理一次。

1.3 幼胚离体培养

将玉米第1次授粉后13～20 d的杂交穗取回，小心剥取颖果。在超净工作台上先用70%酒精表面灭菌30 s，然后用0.1%的升汞灭菌10～15 min，无菌水冲洗3～4次，解剖镜下剥取幼胚，接入培养基处理。培养基设2种不同处理:不添加任何激素的1/2 MS+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH 5.8;1/2 MS+0.2 mg/L 6-BAP+0.2 mg/L IAA+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH 5.8。25℃下暗培养，待幼胚萌发后置于20℃、16 h/d光照条件，大约14 d后观察幼胚的萌发和成苗情况。

萌发率=(幼胚萌发数/接种胚数)×100%;成苗率=(成苗数/接种胚数)×100%。

2 结果

2.1 不同胚龄对单倍体萌发率及成苗率的影响

小麦单倍体胚龄为 15～19 d，萌发率从 74.4%～100.0%不等。从图 1 可见，胚龄为 15 d、16 d、17 d、18 d、19 d的小麦单倍体幼胚平均萌发率分别为92.1%、93.8%、98.3%、94.1%和74.4%。小麦幼胚萌发率随着胚龄的增加而相应提高，并在胚龄为17 d时达到最大，随后下降，在胚龄为19 d时，萌发率最低。

图1 胚龄对小麦单倍体幼胚萌发率的影响Fig.1 Effects of embryo age on germination rate of haploid from wheat×maize

胚龄为15～19 d的小麦幼胚成苗率从16.3% ～64.4%不等。由图 2 可见，胚龄为 15 d、16 d、17 d、18 d、19 d 的小麦幼胚平均成苗率分别为51.3%、64.4%、62.4%、20.1%和16.3%。可见，小麦幼胚成苗率随着胚龄的增加相应提高，并在16 d时达到最大，随后，成苗率开始下降但较为缓慢，胚龄为17 d后，成苗率急剧下降。

图2 胚龄对小麦单倍体幼胚成苗率的影响Fig.2 Effects of embryo age on seedling rate of haploid from wheat×maize

2.2 激素对幼胚萌发及成苗的影响

胚龄同为16 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌发率分别为 100.0%、92.8%，成苗率分别为71.5%、78.6%;胚龄同为17 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌发率同为100.0%，成苗率分别为60.0%、71.4%;胚龄同为18 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌发率分别为82.1%、100.0%，成苗率分别为6.8%、33.3%。表明，培养基中没有添加激素的不育株成苗率较添加的高，但添加激素与否对萌发率的影响结果不一致。

3 讨论

胚龄的大小对幼胚的离体培养十分重要。从本研究可以看出，胚龄从15 d到17 d，随着胚龄的增加其胚的萌发率提高，此后开始下降，至19 d时萌发率最低;成苗率在胚龄为16 d时达到最大，从17 d时开始急剧下降，这一结果基本与吕国锋等人［6］的研究相同。可见，胚龄为16 d时，其萌发率和成苗率较高，是较为合适的幼胚培养时期。

蔡黎明［9］研究认为，1/2MS培养基中添加 0.2 mg/L IAA和0.2 mg/L 6-BAP的培养效果较不添加激素的效果好，但本试验的结果却是不加激素的材料其成苗率较添加0.2 mg/L IAA和0.2 mg/L 6-BAP的成苗率高。IAA和6-BAP分别起促进生根及促使嫩芽分化的作用，如果浓度不适宜则起不到作用。从本试验结果来看，0.2 mg/L可能不是最适宜小麦单倍体胚的激素浓度才导致其成苗率不如不添加激素的效果好，因此关于适宜的激素浓度还有待于进一步的研究。

［1］BARELY I R.High frequencies of haploid production in wheat by chromosome［J］.Nature，1975，256:410-411.

［2］ZENKTELER M，NITZSCHE W.Wide hybridization experiments in cereals［J］.Theor Appl Genet，1984，68:311-315.

［3］LAURIE D A.Wheat × maize hybridization［J］.Can J Genet Cytol，1986，28:313-316.

［4］LAURIE D A，BENNET M D.The production of haploid wheat plants from wheat× maize crosses［J］.Theor Appl Genet，1988，78:393-397.

［5］LAURIE D A，BENNET M D.The effect of the crossability of Kr1 and Kr2 on fertilization frequency in bihaploid wheat×maize crosses［J］.Theor Appl Genet，1987，73:403-409.

［6］吕国锋，范金萍，高德荣，等，胚龄对小麦×玉米单倍体植株产生的影响［J］.江苏农业学报，2003，19(1):59-60.

［7］陈新民，陈 孝，徐惠君，等.利用小麦与玉米杂交产生小麦单倍体的研究［C］//庄巧生，杜振华.中国小麦育种研究进展(1991 ～1995).北京:中国农业出版社，1997:510-518.

［8］末永一博.与玉米杂交获得小麦双单倍体系统的方法［J］.国外农学——麦类作物，1991(4):29-31.

［9］蔡黎明.小麦单倍体幼胚离体培养研究［J］.中国农学通报，2006，22(7):313-315.

［10］姚景侠，李浩兵，钟少斌，等.小麦与玉米杂交及单倍体的产生［J］.植物学通报，1995，12(3):31-35.