玉米赤霉烯酮残留检测ELISA试剂盒的研制

万宇平， 韩 黎， 吴 鹏， 冯才伟， 赵静雅， 李 勇

(1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206;2.解放军疾病预防控制所，北京 100071)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又称F-2雌性发情激素，分子式 C18H22O5，相对分子量 318［1］。ZEN的熔点为161～163℃，在食品或饲料加工过程中均不易破坏［2］。ZEN是由禾谷镰刀菌等菌种产生的次级代谢产物，主要污染玉米、大麦、小麦等作物，在世界各地粮谷与饲料中均有存在，其具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，给畜牧业带来很大的经济损失［3-4］。此外，ZEN还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性、潜在致癌性等，最新研究结果显示其对女性乳腺肿瘤发生也有一定影响［5-6］。法国、意大利、德国、巴西、俄罗斯、加拿大等国家均已制定了ZEN在饲料及粮食谷物中的最大含量(50～250 μg/kg)［7-8］。中国规定小麦、玉米中 ZEN含量不得超过 0.06 mg/kg［9］。

目前ZEN的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、高效液相色谱-质谱联用法以及酶联免疫法等［10］。酶联免疫法近几年发展迅速，其中张晓等［7］运用间接竞争酶联免疫法测定动物饲料中ZEN含量，其最低检出限为0.1 μg/kg，该法检测回收率范围为67.0%～99.0%;王玉平等［11］研制了ZEN ELISA快速检测试剂盒，该试剂盒最低检出浓度为10.0 μg/kg，对玉米和小麦平均加标回收率分别是96.5% 和95.5%;刘涛等［12］利用直接竞争酶联免疫法检测大麦中ZEN含量，最低检出限为4.0 μg/kg，样品加标回收率为73.3% ～96.7%。王雄等［13］研发了间接竞争ELISA试剂盒，最低检出质量浓度为10.0 μg/kg，对玉米和小麦的平均添加回收率分别是92.5%和91.7%;王元凯等［14］建立的间接竞争酶联免疫试剂盒最低检出浓度为1.0 μg/L，对玉米和小麦的平均加标回收率分别是96.5%和95.5%。这些研究还仅仅停留在研究阶段，没有进行试剂盒的市场化，本研究拟合成ZEN的半抗原并进一步制备出抗原，最终得到抗ZEN的单克隆抗体，试图建立饲料中ZEN残留的酶联免疫检测方法，为ZEN试剂盒的推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

ZEN、盐酸羟胺、吡啶、四氢呋喃、琥珀酸酐、氯甲酸异丁酯、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等生化试剂均购自上海华美公司，碳酸钠、二甲基甲酰胺、戊二醛等生化试剂均购自北京陆桥有限责任公司。

1.2 仪器

酶标仪MK3、微量移液器购自美国Thermo公司;氮吹仪KL512购自美国Organomation公司;磁力搅拌器90-2购自上海振荣科学仪器有限公司;低速离心机Anke TDL-40B购自上海安亭科学仪器有限公司;电子天平2000SBL购自美国Setra公司;生化培养箱DHP-600购自天津市中环实验电炉有限公司。

1.3 方法

1.3.1 半抗原制备 将ZEN与盐酸羟胺缩合反应，引入一个新的羟基，再与琥珀酸酐反应得到具有羧基官能团的半抗原。半抗原的具体步骤:159 mg ZEN与盐酸羟胺在5.0 ml吡啶溶液中室温搅拌12～24 h，旋蒸除去吡啶和未反应的羟胺，得到粗产物，加入5.0 ml四氢呋喃和200 μl吡啶，室温搅拌0.5 h，滴加溶于1.0 ml四氢呋喃溶液中的50 mg琥珀酸酐，室温反应12～24 h，旋蒸除去溶剂和吡啶，柱层析纯化，得到ZEN半抗原。

1.3.2 免疫原制备 将ZEN半抗原与BSA进行偶联得到免疫原。具体操如下:取ZEN半抗原8 mg用1.0 ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解，取氯甲酸异丁酯8 μl加入，10℃搅拌反应30 min，即可得到反应液A;称取BSA 60 mg，使之充分溶解在2.0 ml 50 mmol/L碳酸钠溶液中得B液;将反应液A逐滴缓慢滴加到反应液B中，10℃反应4 h，然后4℃过夜;用0.01 mol/L PBS透析3 d，每天换3次透析液。分装，于－20℃保存备用。

1.3.3 包被原制备 将ZEN半抗原与OVA偶联得到包被原。具体操作如下:取ZEN半抗原5 mg用1.0 ml DMF溶解，取氯甲酸异丁酯5 μl加入，10℃搅拌反应30 min，即可得到反应液A;称取OVA 30 mg，使之充分溶解在2.0 ml 50 mmol/L碳酸钠溶液中得B液;将反应液A逐滴缓慢滴加到反应液B中，10℃反应4 h，然后4℃过夜;用0.01 mol/L PBS透析3 d，每天换3次透析液。分装，于－20℃保存备用。

1.3.4 抗体制备 将ZEN-BSA与等量福氏佐剂混合后，以皮下多点注射方式免疫Balb/c小鼠;免疫4次后摘取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并筛选阳性细胞株;对筛选出的阳性细胞株亚克隆，纯化后进行扩增;用扩增后的阳性骨髓瘤细胞对Balb/c小鼠进行腹腔注射，7 d后收集腹腔液，纯化后即可得ZEN单克隆抗体。

1.3.5 ELISA 检测方法的建立

1.3.5.1 酶标板制备 用包被液将包被原稀释到适当浓度加入酶标板中，1孔100 μl;37℃孵育2 h，倒掉余液，用洗涤工作液洗涤1次;加入封闭液1孔150 μl，37 ℃孵育 2 h，甩掉其中溶液，拍干。

1.3.5.2 酶标抗体制备 将10 mg酶溶于0.2 ml含1.25%戊二醛的0.10 mol/L pH6.8 PBS中室温放置18 h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1.0 ml然后加入1.0 ml(含5 mg)抗体溶液和1.0 ml 1.00 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24 h，加入0.1 ml 0.20 mol/L赖氨酸，置室温 2 h，以 0.15 mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。

1.3.5.3 底物液制备 由A液和B液组成，A液配方为取1 g过氧化脲，10.3 g柠檬酸，35.8 g Na2HPO4·12H2O，100 μl吐温 －20 溶于去离子水，调至pH=5.0，并最终定容至1 000 ml;B液配方为取700 mg四甲基联苯胺，10.3 g柠檬酸溶于去离子水，调至pH值=2.6，并最终定容至1 000 ml。

1.3.5.4 标准曲线的建立 向包被有ZEN抗原的酶标板中加入1孔20 μl的样品溶液或ZEN标准溶液(浓度为 0 μg/ml、5.0 μg/ml、15.0 μg/ml、45.0 μg/ml、135.0 μg/ml、405.0 μg/ml)，并加入 1 孔100 μl的酶标抗体工作液，振荡混匀后于25℃避光环境中反应10 min。洗涤5次后拍干，加入底物A液、B液1孔各50 μl，反应5 min后用浓度为2.00 mol/L的浓硫酸1孔50 μl终止，并用酶标仪检测光密度值(OD)，根据百分吸光度值和标准品浓度的对数绘制标准曲线。

1.3.6 饲料样品的处理 用均质器均质饲料样本;称取(5.00±0.05)g饲料样本至50.0 ml聚苯乙烯离心管中，加入25.0 ml 50%甲醇，用振荡器剧烈振荡5 min，3 000 g以上，室温(20～25 ℃)离心5 min;取500 μl上清液至2.0 ml聚苯乙烯离心管中，加入500 μl 10%氯化钠水溶液混合均匀;取20 μl用于分析。

1.3.7 试剂盒指标的检测 分别对研制的ZEN试剂盒进行交叉反应率检测、检测限检测、准确度和精密度检测以及稳定性检测。

2 结果

2.1 标准曲线

标准曲线呈典型的 S型，线性回归方程为:Y= －2.102 6x+2.744 0，相关系数 r=0.990 0。根据回归方程计算出IC50浓度为25.1 μg/L，试剂盒的线性检测范围为 5.0 ～405.0 μg/L。

2.2 交叉反应率

选择在结构上和玉米赤霉烯酮类似的化合物玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇作为标准品进行反应，检测交叉反应率。结果(表1)显示，试剂盒对玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇的交叉反应率均较高。

表1 交叉反应率Table 1 Results of crossreactivity

2.3 最低检测限

按照国际标准计算筛选法的最低检测限，检测阴性饲料样品20份，计算其实测浓度平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限。结果显示，试剂盒对饲料样品的最低检测限为93.5 μg/kg。

2.4 准确度

准确度用添加回收试验进行检测。将ZEN添加到阴性饲料样品中，使其终浓度分别为100.0 μg/kg、200.0 μg/kg、400.0 μg/kg，每个浓度设 6 个重复，以添加回收率确定其准确度。结果(表2)显示，试剂盒对添加3个浓度ZEN标准品的饲料样品回收率为74.5%～109.9%，变异系数均小于12.9%。

表2 准确度检测结果Table 2 Results of accuracy

2.5 精密度

用ZEN试剂盒检测浓度为45.0 μg/L的标准品10次，共用3批试剂盒检测，计算批内及批间变异系数。结果(表3)显示，用试剂盒检测浓度为45 μg/L标准品的批内变异系数均小于5.0%，批间变 异系数为4.2%。

表3 精密度检测结果Table 3 Results of precision

2.6 稳定性

将试剂盒于4℃和37℃条件下保存，在不同时间制作标准曲线并检测阴性样品和阳性样品，依据浓度为0标准品OD值、曲线线性相关系数、IC50值、曲线抑制率、样品回收率判断试剂盒稳定性。结果(表4)显示，试剂盒放置于4℃、保存12个月时进行检测，各项指标均正常，保存至14个月时，浓度为0标准品的OD值、标准曲线的相关系数及样品回收率均已不符合产品质量要求。试剂盒置于37℃进行加速试验，保存至8 d时进行检测，各项指标均正常，保存至10 d时，浓度为0标准品的OD值、标准曲线的相关系数均已不符合产品质量要求，综合以上2个保存试验结果得知，试剂盒保存期为12个月。

表4 稳定性检测结果Table 4 Results of stability

3 讨论

酶联免疫分析法是将抗原抗体特异性结合与酶对底物的高效催化结合起来的一种检测技术，已在小分子检测领域中得到广泛应用，是目前公认的最适合作为药物残留检测的方法之一［15-16］。用于小分子物质检测的一般为竞争法，根据原理的不同又可分为直接竞争法和间接竞争法［17］。

本研究在抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体基础上，研制出ELISA定量检测试剂盒。根据试剂盒方法所绘制标准曲线的线性回归方程为:Y= －2.102 6x+2.744 0，相关系数r=0.990 0，IC50浓度为25.1 μg/L，试剂盒的线性检测范围为5.0～405.0 μg/L，最低检测限为 93.5 μg/kg;交叉反应试验表明，抗ZEN抗体对玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇交叉反应率均较高(≥73%)，因此本试剂盒可以检测玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇总残留量。试剂盒对添加3个浓度ZEN标准品的饲料样品的回收率为74.5% ～109.9%，均符合技术要求;从精密度结果可以看出，对标准品重复检测，批内变异系数小于4.9%，批间变异系数为4.2%，而试剂盒对添加3个浓度ZEN标准品的饲料样品的检测结果的变异系数均小于12.9%，均符合质量要求，造成标准品和样品的变异系数差别较大的原因主要是因为饲料中杂质较多，经前处理后得到的样品溶液中成分复杂，影响试验的均一性;试剂盒在4℃下可放置12个月，同时进行加速试验得知，试剂盒在37℃下可放置8 d，表明测试盒可在4℃环境下保存12个月，具有较高的稳定性。

以上结果表明本试剂盒技术参数均达到一般技术要求，且具有快速、灵敏、特异性好并可同时检测大量样品等优点，本方法可以作为大批样品的快速筛选方法，值得推广应用。

［1］计 成.霉菌毒素生物降解技术在动物生产中的应用［J］.饲料与畜牧，2012(10):1.

［2］余 涛，李大刚，邓 宁，等.玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及特性分析［J］.食品与机械，2012，28(1):78-82.

［3］王留涛，李小康，吴庭才，等.一例母猪玉米赤霉烯酮中毒伴发子宫炎的诊治［J］.畜牧与兽医，2012，44(9):108-109.

［4］罗雪云，胡 霞，李玉伟.小麦，小麦制品及玉米中玉米赤霉烯酮的薄层色谱测定［J］.卫生研究，1993，22(2):112-115.

［5］赵建华，邹 杨，姜淑贞.玉米赤霉烯酮毒害作用研究进展［J］.山东畜牧兽医，2008(8):45-47.

［6］余增丽，张立实，李群英，等.大豆异黄酮和玉米赤霉烯酮对卵巢癌细胞株PEO4增殖的影响［J］.中华预防医学杂志，2003，37(3):154-156.

［7］张 晓，张晴晴，程罗根，等.动物饲料中玉米赤霉烯酮 ELISA检测方法的建立［J］.江苏农业学报，2007，23(4):351-355.

［8］PALLARONI L，VON H C，ESKILSSON C，et al.Microwave-assisted extraction of zearalenone from wheat and corn［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2002，374(1):161-166.

［9］杨振东，宁 炜，徐 丹，等.玉米赤霉烯酮人工抗原的合成以及抗体的制备［J］.分析科学学报，2011，27(2):157-161.

［10］何庆华，许 杨.玉米赤霉烯酮毒性研究及检测方法进展［J］.卫生研究，2005，34(4):502-504.

［11］王玉平，计 融，江 涛，等.玉米赤霉烯酮ELISA定量检测试剂盒研制［J］.卫生研究，2006，35(2):221-225.

［12］刘 涛，王向红，常 彧，等.直接竞争酶联免疫法检测大麦中玉米赤霉烯酮［J］.食品与机械，2008(2):97-117.

［13］王 雄，荣 钊，蒙海超，等.抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及ELISA检测试剂盒的研制［J］.饲料研究，2010(11):39-42.

［14］王元凯，王 君，王雨晨，等.玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测方法的建立［J］.微生物学通报，2011，38(12):1793-1880.

［15］彭运平，齐 维，唐海波，等.应用酶联免疫法检测鱼肉、蜂蜜中氯霉素的残留量［J］.现代食品科技，2010，26(12):1415-1417.

［16］畅 红.苏建亚Bt毒素受体钙黏蛋白的酶联免疫检测方法［J］.江苏农业科学，2011，39(1):135-137.

［17］李玉珍，林亲录，肖怀秋.酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用研究进展［J］.中国食品添加剂，2006，3(108):108-112.