转hLYZ基因山羊繁殖、遗传及 hLYZ基因的表达稳定性

乔 娜， 徐旭俊， 刘思国， 王学斌， 陈建泉， 成国祥

(1.上海杰隆生物工程股份有限公司，上海 201210;2.上海转基因研究中心，上海 201210)

溶菌酶(Lysozyme)是广泛分布于人和动物机体组织和体液中的一种重要非特异性免疫因子，其在食品医药行业具有重要意义［1-4］。人溶菌酶(Human lysozyme，hLYZ)具有广谱抗菌作用，对引发乳腺炎的金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等具有明显抑制作用［5］。但人溶菌酶制备材料相当有限，通常是从人奶、胎盘或尿液中少量提取，来源极其困难，无法进行工业化生产［6-8］。利用乳腺生物反应器生产重组蛋白质，使转基因动物分泌的乳汁中含有较强抑菌作用的人溶菌酶成为近几年的研究热点。随着转基因技术的不断成熟，转人溶菌酶基因小鼠、猪、山羊、牛等转基因动物已经先后获得［9-13］。同时，牛、羊等哺乳动物产奶量高，且在动物乳汁蛋白质合成过程中可以使伴随表达的外源蛋白质进行真核生物所特有的修饰和加工，使外源蛋白质具有较高的生物活性，易于外源蛋白质的大规模生产。因此，牛、羊成为制备乳腺生物反应器的理想动物类型。

但有研究表明，转基因山羊、小鼠乳汁内高效表达异源蛋白质后可对受体动物正常乳腺上皮细胞内蛋白质合成有一定影响，使泌乳性能下降。通过育种手段改善转基因动物的生产性能，成为转基因动物育种新的目标。本研究对转hLYZ基因山羊扩群中的繁殖、外源基因遗传、表达稳定性等进行分析，为转基因山羊安全评价、转hLYZ基因山羊的繁育与检测方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及来源

转hLYZ基因山羊G0代为上海转基因研究中心利用体细胞克隆方法自主研发获得的原代健康转hLYZ基因母羊，非转基因普通奶山羊选购自江苏省徐州睢宁县。以6只原代转hLYZ基因母羊为基础，与普通奶山羊公羊自然交配，且从转基因后代羊中挑选优秀公、母羊，进行兄妹交配或回交，逐渐组成 F1、F2和 F3代。

1.2 繁殖方式及数量

对各世代的子代数量、转基因整合羔羊数、外源基因整合率等相关信息进行记录统计。G0代hLYZ母羊与正常健康非转基因奶山羊公羊自然交配，所生后代中整合检测呈阳性个体，为F1代转hLYZ基因羊。F1代hLYZ公羊与正常健康非转基因奶山羊、G0代、F1代等转hLYZ基因母羊自然交配，所生后代中整合检测呈阳性个体，均定义为F2代转hLYZ基因羊。F2代公羊与正常健康非转基因奶山羊、G0代、F2代转hLYZ基因母羊自然交配，所生后代中整合阳性个体，为F3代转hLYZ基因羊。各世代繁殖方式与数量详见表1。

1.3 人溶菌酶的PCR整合检测

分别取 F1、F2和 F3代待测羊血液 200 μl，使用北京天根公司的血液 DNA提取试剂盒(货号:DP318-02)提取DNA，使用TaKaRa公司的LaTaq酶进行PCR扩增检测。引物为上游引物:5'-CCTCATAATTCCCTGAGTAAG-3'，下 游 引 物:5'-TGACACTGAGGATTCCACATG-3'，扩增目的片段大小约为850 bp。

PCR扩增体系为:94℃ 5 min;94℃ 40 s，59℃40 s，72 ℃ 50 s，30 个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。扩增产物取 5 μl上样，1%Agrose 120 V，电泳 20 min后，拍照鉴定。PCR结果呈阳性的个体，为整合转基因羊。

1.4 转基因母羊乳汁中hLYZ的Western-blot检测

收集G0、F1和F2代hLYZ羊乳汁样品，用无菌双蒸水进行恰当稀释，加入等体积的SDS上样缓冲液，煮沸变性5 min，离心，取2 μl上清液进行SDSPAGE电泳，凝胶浓度为12%;蛋白质杂交一抗选用兔抗人溶菌酶(DAKO，A0099)，1∶3 000稀释使用;二抗选用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime，A0208)，1∶3 000稀释使用。杂交、洗膜等步骤参照常规Western-blot方法进行。

1.5 转基因母羊乳汁中hLYZ的ELISA检测

G0、F1和 F2代 hLYZ 羊乳汁样品 100 μl，选用AssayMax Human Lysozyme ELISA Kit(AssayPro，EL3020-1)进行精确定量，检测详细步骤参照试剂盒说明书。

2 结果

2.1 转hLYZ基因山羊的繁殖

根据不同交配类型，对各世代转基因山羊的子代数量、转基因整合情况进行统计。经过3个繁殖周期，共获得 F1代9只，转基因整合率28.13%(9/32);F2代 140只，转基因整合率 45.31%(140/309);F3代 22只，转基因整合率 40.00%(22/55)(表1)。

表1 各世代羊数量及整合情况Table 1 Numbers of goats and transgenic goats in each generation

2.2 各世代转基因山羊的PCR整合检测与遗传稳定性分析

部分人溶菌酶转基因山羊PCR整合检测结果如图1所示，图中1～10为待检测羊只PCR扩增产物，阴性对照选用普通奶山羊基因组扩增产物。整合个体在850 bp处有清晰、特异性扩增产物。该检测结果证实，人溶菌酶基因能够在转基因羊世代间稳定遗传。

图1 转hLYZ基因山羊PCR整合检测图Fig.1 PCR result for hLYZ transgenetic goats

2.3 hLYZ基因的表达稳定性

为明确人溶菌酶在各世代转基因山羊乳汁中的表达情况，分别应用 Western-blot和 ELISA法对不同世代转基因山羊乳汁中hLYZ基因的表达进行检测。

2.3.1 Western-blot检测 对 G0、F1和 F23 个世代转hLYZ基因山羊乳汁样品进行Western-blot检测，结果(图2)显示，各世代转基因山羊乳汁中均能检测出与rhLYZ标准品(阳性对照)大小一致的特异性条带，正常奶山羊乳汁样品(阴性对照)则无相应条带，表明各世代转基因山羊乳汁中均表达出hLYZ蛋白质。

图2 转hLYZ基因山羊乳汁中表达产物的Western-blot检测图Fig.2 Western-blot result for hLYZ in transgenic goat milk

2.3.2 转基因山羊乳汁中hLYZ的ELISA检测采用ELISA法测定转基因山羊乳汁中hLYZ含量，ELISA 标准品浓度依次为 0 μg/ml、0.093 μg/ml、0.187 μg/ml、0.375 μg/ml、0.750 μg/ml、1.500 μg/ml、3.000 μg/ml、6.000 μg/ml;待测乳汁样品稀释16 000倍，每个样品2个重复。空白对照为EIA Diluent稀释液(试剂盒提供)，阴性对照为普通奶山羊乳汁，阳性对照为rhLYZ标准品。检测结果显示，待测样品各孔吸光度均在标准曲线线性范围内，且重复性较好。根据标准品各孔OD450值与浓度梯度值，以吸光度为Y轴，以浓度为X轴，采用四参数Logistic曲线拟合。标准曲线公式为:Y=d+(ad)/［1+(x/c)^b］;式中:参数 a=0.019，参数 b=－0.958，参数 c=0.118，参数 d=2.666;R2=0.995 5。结果(表2)显示，G0、F1和 F23 个世代转基因山羊乳汁中hLYZ含量分别为3.46 g/L、2.28 g/L和 2.22 g/L。

表2 各世代转基因山羊乳汁中hLYZ表达量Table 2 HLYZ expression level in transgenic goat milk of each generation

3 讨论

人溶菌酶在人体内广泛表达，其中人乳中含量为50～250 mg/L。采用DNA重组技术，利用原核或真核表达系统对人溶菌酶进行规模化生产，最终获得的人溶菌酶含量也不尽相同。酵母和霉菌细胞壁的几丁质成分是人溶菌酶的最适作用底物之一，当人溶菌酶在酵母或霉菌中表达时，人溶菌酶以活性形式存在，对酵母或霉菌细胞壁有溶解作用，从而影响工程菌的生长发育，最终降低表达水平［6］。以大肠杆菌为宿主生产人溶菌酶，产量在2 mg/L以下;以霉菌作为宿主生产人溶菌酶，产量可达到40 mg/L［14-15］。目前，利用哺乳动物体细胞大规模生产人溶菌酶已成为现实。本研究转基因山羊能够利用乳腺特异、高效的表达人溶菌酶(hLYZ)，经过3个世代的繁育，hLYZ基因能够在山羊世代间遗传，且获得的转基因子代羊只健康状况良好，3个世代母羊乳汁中hLYZ蛋白质平均表达量大于2.00 g/L。

hLYZ基因位于人类第12染色体上，呈显性效应遗传［6］。本研究G0代转基因山羊是采用体细胞克隆技术获得的携带有hLYZ基因的杂合子母羊。通过常规育种方法获得的子代hLYZ整合杂合子羊，乳汁中能稳定表达hLYZ蛋白质，表明该外源基因在山羊染色体上的遗传效应与在人类染色体上相似。hLYZ基因的转入，未对转基因羊群的繁殖能力产生显著影响，表明该基因能够在山羊群体世代间遗传和稳定表达。

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