猪二磷酸腺苷-核糖基化因子6的克隆与原核表达

马金友， 余 燕， 吴世秀， 张金洲， 赵恒章， 徐之勇

(1.河南科技学院动物科学学院，河南 新乡 453003;2.河南科技学院动物病毒研究所，河南 新乡 453003)

2006年以来高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行使养猪业遭受了重大损失，因此，通过“以防为主”，提高猪自身免疫能力以增强其抗病力，是解决猪病及抗生素等药物滥用问题的一条非常有效的途径。目前，对于PRRSV免疫预防研究工作已经取得了一些进展［1－2］，但对病毒入侵宿主细胞后，一些相关免疫因子对病毒感染过程中的囊泡运输系统是如何调控的还知之甚少，尤其在病毒的复制或参与病毒防御等方面。

二磷酸腺苷－核糖基化因子(ADP－ribosylation factors，ARFs)属于小G蛋白质Ras家族，最初命名是根据它能作为霍乱毒素催化GS蛋白质ADP核糖基化反应的辅助因子，在N端第二位(通常为氨基酸G)发生肉豆蔻酰基化［3］。研究发现ARFs在细胞囊泡运输、磷脂代谢、细胞骨架重组及调节细胞吞噬等方面起重要作用［4－5］，近期报道哺乳动物的一些ARF 成员与病毒的感染有关［6－7］。ARF6 作为 ARFs的重要成员之一，其功能由ARF6的效应子GTP酶激活蛋白质GAPs和鸟苷交换因子GEFs相互协调来实现［8－9］。

ARF6效应子可以特异性地通过PH结构域与3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇［Phosphatidylinositol 3，4，5－trisphosphate，PtdIns(3，4，5)P(3)］相结合，使其蛋白质向细胞膜上迁移，通过 Ras－Raf－MEK－ERK1/2途径调控细胞功能，从而参与到信号转导通路中［9－10］，ARF6 通过它的 GAP－Centaurin－α1 行使调控功能［11］，间接地参与到病毒感染和抗病毒过程中［12］，同时，也是细胞信号转导 PI3－K 途径下游的重要成员［10，13］，因此 ARF6 效应子可能与猪抗病毒免疫密切相关。为了了解ARF6在PRRSV感染中的免疫防御作用和调节机制，本试验拟通过猪arf6基因的克隆与分析，构建该基因的原核表达载体以获得抗血清，为进一步研究猪ARF6在PRRSV感染过程中的调控作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

限制性内切酶BamH I与EcoRⅠ(TaKaRa公司生产)、反转录酶 M-MLV(TaKaRa公司生产)、Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司生产)、PMD18－T 载体(TaKaRa公司生产)、T4 Ligase(TaKaRa公司生产)、DL2000 marker(TaKaRa公司生产)、6 mer随机引物(TaKaRa公司生产)、质粒提取试剂盒(Omega公司生产)、DNA回收试剂盒(Omega公司生产)、亲和层析纯化柱及相关试剂(Novagen公司生产)、100 bp Marker(Tiangen公司生产)等均购于郑州久是生物有限责任公司;琼脂糖、蛋白胨和酵母浸出膏等均购自上海生工生物工程技术有限公司;枪头和离心管(Axygen公司生产)购于北京鼎国工程公司;其他常用试剂均为国产分析纯试剂。PGEX－4T－2载体和大肠杆菌(Escherichia coli Top10、BL21)由河南科技学院动物科学学院兽医学平台实验室保藏。

从河南科技学院动物科学学院取疑似PRRSV感染的杜洛克猪肺、脑、心脏等组织，液氮冻存带回实验室处理。

1.2 引物设计

根据NCBI(National center for biotechnology information)对猪arf6(FJ455238)序列设计扩增arf6全长ORF引物［SArf6F(上游引物):5'－GCGATGGGGAAGGTGCTATC－3'和 SArf6R(下游引物):5'－GCTCATTAGGATTTGTAGTTAGAGG－3'］和原核表达引物［SArf6F1(上 游 引 物):5'－CC GGATCCATGGGGAAGGTGCTATC－3'和 SArf6R1(下 游 引 物):5'－GC GAATTCTCATTAGGATTTGTAGTTAGAGG－3'， 下划线为酶切位点］。引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。根据猪actin(XM_003124280)序列设计组织分布的半定量PCR引物［SactinF(上游 引 物):5'－AAGGACCTCTACGCCAACACG－3' 和SactinR(下游引物):5'－GTCGTACTCCTGCTTGCTGATCC－3'］。

1.3 方法

1.3.1 猪arf6基因扩增

1.3.1.1 总RNA提取 取适当组织(100 mg以下)于研钵(180℃烘烤3 h)中加入液氮充分研磨，然后加入1.0 ml Trizol(Invitrogen)混匀，转移至1.5 ml离心管中，室温放置10 min;12 000 g，4℃离心10 min;上清液转移至离心管，每1.0 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，剧烈摇动15 s左右，室温放置8 min左右;12 000 g，4℃离心15 min;上层水相转移至离心管中，加入0.5 ml异丙醇混匀，室温放置8 min;12 000 g，4℃离心8 min;弃上清液，1.0 ml 75%乙醇洗 1 min，7 500 g，4 ℃离心5 min，重复洗1 次;弃上清液，空气干燥3 min，加入60.00 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀。

1.3.1.2 cDNA合成 总体系为20.00 μl。配制1.00 μl 6 mer随机引物 (100 ng/μl)，4.00 μg 总RNA，1.00 μl 10 mmol/L dNTP 混合物，用 DEPC 水补充至14.00 μl;PCR仪中65℃加热5 min，然后冰浴至少1 min;轻微离心一下，然后加入以下成分:4.00 μl 5 × First－strand buffer，1.00 μl Rnase inhibitor，1.00 μl反转录酶M-MLV;PCR仪中25℃温浴5 min，42℃温浴60 min，70 ℃加热15 min，4 ℃后保存于冰箱中备用。

1.3.1.3 arf6基因扩增 PCR反应管中分别加入以下成分:10 × Ex Taq buffer 2.50 μl，2.5 mmol/L dNTP 混合物2.00 μl，上、下游引物各1.00 μl，10 倍稀释的反转录产物 2.00 μl，Ex Taq DNA Polymerase 0.25 μl，补充灭菌三蒸水至 25.00 μl。PCR 反应程序如下:95 ℃，3 min;95 ℃ 35 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30个循环;72℃再延伸5 min，4℃终止。

1.3.2 基因扩增产物的回收、连接和测序 检测扩增的目的片段，根据DNA回收试剂盒说明回收目的片段;0.5 ml离心管中依次加入:载体(PMD18－T)0.40 μl，目的片段 6.00 μl，10 × Ligation buffer 1.00 μl，T4 Ligase 0.60 μl，灭菌三蒸水补充至 10.00 μl，16℃连接6 h;连接产物转化Top 10细菌和转化细菌的检测及测序，正确测序产物质粒的提取、保存。

1.3.3 猪arf6组织分布 提取猪下丘脑、胸腺、肺、肺部淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肌肉、十二指肠、空肠、回肠等组织总RNA，反转录为cDNA，以actin为内标半定量PCR检测arf6的组织分布。

1.3.4 序列分析 根据Blast程序 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)分析核酸序列，Signal P 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白质的保守结构域及信号肽。

1.3.5 猪ARF6融合蛋白质原核表达载体构建与表达

1.3.5.1 arf6基因表达序列的扩增 扩增引物为SArf6F1和 SArf6R1，模板为含 arf6序列的质粒PMD18－T－arf6，其它成分和程序参照方法 1.3.1.3的成分和步骤。

1.3.5.2 扩增的arf6序列和表达载体的酶切及回收1.5 ml Eppendorf管中分别依次加入:内切酶缓冲液 5.00 μl;DNA 片段和 PET－4T－2 分别为 43.00 μl;BamHⅠ1.00 μl，EcoRⅠ1.00 μl，37 ℃酶切2.5 h。酶切后的片段回收按照DNA回收试剂盒说明进行。

1.3.5.3 表达载体和目的片段连接、转化及检测0.5 ml离心管中依次加入:酶切载体(PGEX－4T－2)1.50 μl，待连接的酶切 arf6 片段 6.50 μl，10 × Ligation buffer 1.00 μl，T4 Ligase 1.00 μl，总体积 10.00 μl，16℃连接6 h。连接产物转化Top 10细菌，转化细菌的菌落检测和质粒双酶切检测验证，符合要求的菌落测序，正确测序产物质粒的提取、保存。

1.3.5.4 猪ARF6－GST重组融合蛋白质的表达转化重组质粒于BL21细菌，挑选单菌落于2.0 ml LB(含100 IU/ml氨苄青霉素)液体培养基37℃摇培8 h;加入异丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.2 mmol/L，37℃继续摇培3 h;取菌液1.0 ml，离心去上清液，加入2×SDS－PAGE上样缓冲液 50.00 μl，混匀;沸水浴 5 min，10 000 g 离心 1 min;取 8.00 μl进行 SDS－PAGE，检测重组融合蛋白质的表达;表达的融合蛋白质进行可溶性分析。

1.3.5.5 猪ARF6－GST重组融合表达蛋白质的纯化 挑选检测表达的菌落接种于5.0 ml LB(含100 IU/ml氨苄青霉素)液体培养基37℃摇培过夜;1∶100接种于200.0 ml LB(含100 IU/ml氨苄青霉素)液体培养基37℃摇培3 h，加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L，18℃继续摇培16 h;收取菌液4℃，6 000 g离心10 min;去上清液，加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.36)15.0 ml，悬浮细菌;冰浴中超声破碎，4℃，12 000 g离心20 min;上清液转移至新管中，加入1.0 ml GST纯化介质，4℃混匀3 h;上柱，收集流过液，PBS缓冲液洗柱，至流过液OD280接近于零;4.0 ml谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，SDS－PAGE鉴定纯化的蛋白质。

2 结果

2.1 猪arf6基因的克隆及结构特征

通过猪肺脏和脑组织总RNA的提取、反转录和基因扩增，得到了与目的基因片段大小一致的条带(图1)，测序比对后确认为猪arf6基因，大小为530 bp左右。

图1 猪arf6基因RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplification of arf6 gene from swine

猪arf6基因包含一个长度为528 bp开放阅读框，预测编码175个氨基酸，理论分子质量约为20 080，pI为8.97。通过其序列的保守结构域分析发现，猪ARF6蛋白质含有典型的p loop、Switch区、Interswitch区和N端疏水区的Hasp，同时，在N端第二位含有可被肉豆蔻酰基化的甘氨酸。这些结构特征反应了猪ARF6在进化上是高度保守的。信号肽预测该蛋白质序列没有信号肽序列。

2.2 猪arf6的组织分布

分别以猪下丘脑、胸腺、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺、肺部淋巴结、十二指肠、肌肉、空肠、回肠cDNA为模版，以actin基因为内标，进行arf6基因PCR检测。结果(图2)显示，12种组织中均可以检测到arf6基因的转录表达，说明该基因的表达没有组织特异性。

图2 猪arf6基因的组织分布Fig.2 Tissue transcriptional profile of arf6 gene from swine

2.3 猪ARF6融合蛋白质原核表达载体构建、表达与纯化

由于ARF6是细胞中囊泡运输的重要小G蛋白质，可通过它的效应子—Centaurin－α1对病毒的入侵起着重要的调控作用，为了进一步研究ARF6的功能及构建ARF6原核表达载体进行融合蛋白质表达以获得抗血清。本试验设计原核表达引物通过PCR从质粒PMD18－T－arf6中克隆表达序列，双酶切后连接到PGEX－4T－2载体上，菌落PCR获得了和目的片段大小一致的条带，挑选菌落培养后提取的质粒双酶切图谱(图3)进一步证实构建融合蛋白质表达载体的正确性。根据克隆的arf6基因，我们成功构建了猪ARF6原核表达载体用于融合蛋白质ARF6－GST的表达。挑选构建好的表达载体PGEX－4T－arf6转化的细菌，通过一系列的诱导表达获得可溶性的融合蛋白质，并经过亲和层析柱纯化获得了ARF6－GST融合蛋白质(图4)。该融合蛋白质经浓度测定可作为制备抗血清的抗原。

图3 ARF6-GST融合蛋白质表达质粒的双酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant fusion protein plasmid ARF6-GST

图4 ARF6-GST融合蛋白质的可溶性分析与纯化Fig.4 Solubility analysis and purification of the expressed fusion protein ARF6-GST

3 讨论

ARFs是一类高度保守的GTP激酶，是分泌性囊泡形成的主要因子，同时在细胞器的形成、生物合成、胚胎发育、调节细胞吞噬及物质运输中起重要的调控作用，尤其内质网和高尔基体之间的囊泡运输过程是必不可少的［4－5］。哺乳动物的一些ARF成员被病毒挟持参与了病毒装配、复制和释放［6－7］。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有导致怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重病症特征，尤其2006年后该病的暴发使养猪业遭受了重大损失。研究中发现PRRSV感染早期猪arfs基因表达明显上调。另外，我们克隆了猪arf6开放阅读框序列并构建了他们的原核表达载体，发现该ARF6具有其他动物的保守结构域且序列结构也很保守，说明这些小的GTP激酶在细胞内部执行着非常重要的功能。虽然ARF6在一些哺乳动物的病毒感染中扮演着不同的角色，但猪ARF6与病毒的关系目前还没有具体的研究，但是我们仍是可以预见ARF6可能与猪的相关病毒入侵有着密切的相关性。

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