猪链球菌2型体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

汪 伟， 何孔旺， 倪艳秀， 吕立新， 周俊明， 张雪寒， 俞正玉， 茅爱华， 温立斌，王小敏， 李 彬， 郭容利

(江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京210014)

猪链球菌(Streptococcus suis)为革兰氏阳性菌，是猪的一种重要病原体，可引起脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎和肺炎等［1］。现已发现35个血清型(1 ～34型和1/2 型)［2］，最近有报道将 32、34 两型重新归类为鼠口腔链球菌(Streptococcus orisratti)［3］。其中猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人畜共患病病原，人感染SS2主要引起脑膜炎，并伴随败血症、心内膜炎和链球菌中毒休克综合征(STSS)［4］，最终导致死亡。在中国江苏省部分地区(1998 ～1999 年)［5］及四川省(2005 年)均暴发过人感染 SS2 至死事件［6］。

目前关于SS2确切的致病机制仍不清楚［1］，但已经证明某些炎性和传染性疾病与细胞因子的过量产生有关。特别是一些炎症相关细胞因子，如 IL－1β［7］、IL－18［8］、IL－8［9］等 促 炎症细胞因子。IL－12是这些因子的诱导剂并协同参与炎症、介导与临床疾病的恶化、多器官系统衰竭及休克性死亡相关的反应［10］。革兰氏阳性细菌的细胞壁成份是介导炎症反应的主要物质［11］。尽管单核吞噬细胞在脑膜炎、败血症等致病机制中起重要作用，但SS2与猪源单核细胞之间的作用及诱导产生细胞因子的研究并不多。

3D4/21 猪肺泡巨噬细胞是猪肺泡巨噬细胞的体外传代细胞系，在体外已丧失了吞噬功能，但仍保留细胞因子分泌的功能，其作为研究SS2细胞因子转录的模型细胞已有报道［12］。本试验就SS2不同毒力菌株及impdh缺失株对3D4/21细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录的影响进行研究，旨在为SS2致病机制提供一个可能的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Todd hweitt bacto(THB)培养基(美国BD公司产品)，DMEM细胞培养液(美国Invitrogen公司产品)，3D4/21猪肺泡巨噬细胞(美国ATCC产品)，细胞RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司产品)，AMV反转录酶(美国Promega公司产品)，RNA酶抑制剂(大连TaKaRa公司产品)，Oligo(dT)15(大连TaKaRa公司产品)，SYBR Premix ex Taq(大连TaKaRa公司产品)，Rotor－gene 6000定量PCR仪。

1.2 菌株来源

试验所用的 SS2菌株［ZY05719、ZY05719(△impdh)、HA0609、CS100322－1］均由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室保存，菌株来源见表1。

表1 试验中所用菌株的生物来源、地理来源及致病性Table 1 Host of origin，geographic origin and pathogenicity of SS2 strains used in this study

1.3 细菌培养与处理

用THB平板复苏菌株，37℃培养 24～48 h。挑单菌落接种于THB液体培养基，37℃、220 r/min振荡培养16 h。取1 ml菌液6 000 g离心6 min，用无菌PBS洗2次。溶于PBS，60℃水浴45 min以灭活细菌，4℃冰箱保存备用。取灭活后的菌液涂THB平板，37℃培养48 h，以确定是否完全灭活。接种细胞之前用细胞培养液DMEM(10%血清)重悬细菌至1.0×109CFU/ml。

1.4 3D4/21猪肺泡巨噬细胞的培养

3D4/21 猪肺泡巨噬细胞(以下简称3D4/21细胞)是猪肺泡巨噬细胞的体外传代细胞系，培养于含10%血清的DMEM中，长至单层细胞。将已长满单层的细胞用细胞培养液制成细胞悬液(细胞密度为2.0×105CFU/ml)培养于24孔细胞板，每孔1 ml。置 37 ℃、5%CO2下培养 12 h。

1.5 接种

将24孔板上的3D4/21细胞用DMEM洗2次后，每孔接种 SS2细菌悬液 100 μl，补加 DMEM(10%血清)900 μl。800 g、25 ℃离心10 min。同时预留不含SS2细菌的3D4/21细胞，作为细胞因子自然转录对照组。每个菌株3个重复。置37℃、5%CO2下分别作用 6 h、12 h 和24 h。

1.6 细胞RNA的提取与反转录

在不同接种时间点取出细胞板，按Trizol说明书提取细胞总RNA。以Oligo(dT)15作为下游引物，应用AMV反转录酶进行反转录，获得cDNA。20 μl反转录体系:取 Oligo(dT)15(25 pmol/μl)2.0 μl，加入10.0 μl总 RNA，72 ℃ 10 min，冰浴 5 min 后，加入5 × 反转录缓冲液 4.0 μl、dNTP(10 mmol/L)2.0 μl、RNA 酶抑制剂(40 U/μl)1.0 μl、AMV 反转录酶(10 U/μl)1.0 μl，42 ℃ 反转录 1 h，95 ℃ 5 min 灭活后置－20℃冰箱备用。

1.7 荧光定量PCR法检测样品各细胞因子的cDNA拷贝数

用荧光定量 PCR 方法［10，13］检测各细胞因子cDNA 拷贝数。Real－time PCR 20.0 μl反应体系:2 ×SYBR Premix ex Taq 10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，模板 1.0 μl，ddH2O 8.2 μl。反应程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30～60 s(表2)，40个循环。每一循环结束时读取荧光信号。总循环结束后，加入熔解曲线分析步骤。将各细胞因子基因的拷贝数除以同一样本中β-actin基因的拷贝数，获得一个相对比值，以对照组相对比值计为1，求出刺激组与对照组的倍比值(该值计为r)，用以表示相应细胞因子的mRNA转录水平。

表2 各细胞因子和管家基因β-actin荧光定量PCR扩增的引物及条件Table 2 Primers and conditions for real-time PCR to amplify cytokines and housekeeping gene β-actin

1.8 数据统计

菌株与对照组采用r值比较，r＞2为上调转录，r＜0.5为下调转录，r＞5时为过度上调(即过量转录)。

菌株之间数据统计采用FC(倍数改变量)表示，FC＞2或FC＜0.5表明倍数改变有意义。

2 结果

细胞因子转录动力学结果显示，SS2各菌株刺激3D4/21 细胞后 IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12 和 IL-10的mRNA转录水平均有不同程度的变化，大小与刺激时间有关(图1)。

2.1 SS2病菌对3D4/21细胞IL-1β mRNA转录水平的影响

IL－1β是一种重要的促炎症细胞因子，在介导细菌感染后机体的炎症反应中起重要作用。4株SS2病菌在刺激3D4/21细胞6 h后均可以诱导IL-1β mRNA上调转录(r＞2);12 h均恢复至稳定状态(1＜r＜2);24 h后ZY05719仍诱导上调转录，HA0609诱导下调转录(r＜0.5)，另外2株ZY05719(△impdh)和CS100322－1诱导处于稳定状态(图1)。说明强毒株比低毒株和无毒株诱导IL-1β的持续期更长，可长时间刺激IL-1β的产生，刺激机体的炎症反应。

图1 SS2病菌刺激对3D4/21猪肺泡巨噬细胞的细胞因子mRNA转录水平的影响Fig.1 Influence of mRNA level of Streptococcus suis 2 triggered cytokines responses in porcine alveolar macrophages cell lines 3D4/21

2.2 SS2病菌对3D4/21细胞IL-18 mRNA转录水平的影响

IL－18也是一种促炎症细胞因子，与IL－1β同属一个家族。4株SS2病菌在刺激3D4/21细胞6 h后，ZY05719和 ZY05719(△impdh)均诱导 IL-18 mRNA上调转录，且 ZY05719诱导过度转录(r＞5)，转录水平高于其他菌株(FC＞2)，菌株HA0609和CS100322－1诱导处于稳定状态。刺激12 h后，除ZY05719(△impdh)诱导IL-18 mRNA上调转录，其他菌株诱导均处于稳定状态。24 h后，ZY05719、ZY05719(△impdh)、HA0609诱导上调转录，CS100322－1诱导仍保持稳定，但诱导上调的3株之间没有差异(1＜FC＜2)。说明强毒株能够强烈刺激IL-18 mRNA的转录，impdh缺失株及无毒株HA0609也能够刺激IL-18 mRNA转录，但低毒株CS100322－1对IL-18 mRNA的转录没有明显影响。

2.3 SS2病菌对3D4/21细胞IL-8 mRNA转录水平的影响

IL－8 与 IL－1β 和 IL－18 一样，是一种重要的促炎症细胞因子。SS2病菌在刺激3D4/21细胞6 h后，ZY05719(△impdh)诱导 IL-8 mRNA上调转录，CS100322－1出现一定程度的下调转录，而ZY05719与HA0609诱导保持稳定状态。12 h后，ZY05719明显诱导上调转录(r＞5)，且远高于其他菌株(FC＞7);HA0609也诱导上调转录，ZY05719(△impdh)和CS100322－1诱导保持稳定。24 h后，ZY05719诱导仍保持过度上调(r＞5)，且高于其他3株(FC＞5)。说明总体上强毒株能够长时间诱导强烈的IL-8 mRNA转录，且明显强于其他3株;ZY05719(△impdh)及无毒株HA0609同样能够诱导IL-8 mRNA的转录，并持续较长时间;低毒株CS100322－1不能诱导IL-8 mRNA转录，且有一定程度的抑制。

2.4 SS2病菌对3D4/21细胞IL-12 mRNA转录水平的影响

IL－12 是 IL－1β、IL－18 及 IL－8 等促炎症细胞因子的诱导剂并协同参与炎症反应。在测试的3个时间点内，ZY05719(△impdh)与 CS100322－1对 IL-12 mRNA的转录水平没有明显影响(1＜r＜2)，ZY05719和HA0609表现为诱导IL-12 mRNA转录水平随刺激时间延长呈上升趋势。24 h后ZY05179诱导明显上调(r＞5)，且远远高于 impdh缺失株(FC ＞10)，也高于菌株 HA0609和 CS100322－1。说明强毒株更易于诱导IL-12 mRNA的转录，从而有利于促炎症细胞因子的转录，这与前面结果中ZY05719对IL-1β、IL-18和IL-8的mRNA转录水平高于其他菌株一致。

2.5 SS2病菌对3D4/21细胞IL-10 mRNA转录水平的影响

IL－10属于抗炎症细胞因子，其作用是对抗机体的炎症反应。在测试的3个时间点内，ZY05719诱导IL-10 mRNA一直处于上调转录，原因可能是ZY05719诱导促炎症细胞因子过度转录，引发了IL-10 mRNA上调，以维持细胞自身的稳态，抑制过度炎性因子产生，是细胞的一种自我保护反应。HA0609诱导总体处于下调，表明HA0609诱导炎症细胞因子虽上调转录，但未过度转录，维持低量的IL－10将有利于炎症细胞因子的产生，在体内有利于适量的炎症反应，以清除细菌。CS100322－1诱导则处于稳定状态，表明CS100322－1促炎症细胞因子基本没有大的变化，使得IL－10的变化不明显，将不利于炎症反应的进行和细菌的清除，细菌可长时间存活于血液，引发败血症。ZY05719(impdh)诱导与其他3株表现不同，刺激3D4/21细胞开始时IL-10 mRNA上调，然后稳定，最后下调。其原因可能是在刺激6 h时IL-1β、IL-18、IL-8的mRNA均上调转录，而在12 h和24 h部分因子出现下调，进而影响到IL-10 mRNA的转录。推测其感染情况:ZY05719(impdh)开始刺激3D4/21细胞时，产生的促炎症细胞因子与抗炎症细胞因子达到了平衡，动物不发生过度的炎症反应，表现为不发病;随着时间的推移，IL－10水平降低，而多种促炎症细胞因子仍然产生，引发持续的炎症反应，导致动物发病死亡。

3 讨论

本研究证明了SS2病菌可以影响3D4/21细胞IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12 及 IL-10 mRNA 的转录，且这种影响随刺激时间的长短而变化。这些细胞因子可能在机体感染SS2后，在参与或介导炎症反应中起重要作用。但SS2哪些毒力因子参与刺激细胞因子及炎症反应仍没有完全明确。本研究中SS2具有体外刺激免疫细胞的细胞因子转录的能力，这意味着在机体内存在着免疫细胞对SS2的某些成分产生免疫应答，并由此激发各种免疫反应并产生一系列的炎症反应与全身性感染。本研究中发现不同野生SS2菌株的促炎症细胞因子及抗炎细胞因子的转录与菌株介导的炎症存在某些内在联系，对了解SS2体内感染也有着积极意义。

许多研究通过无荚膜包裹突变株已清楚地指出细菌细胞壁成分是主要的细胞因子诱导物，但其机制仍不清楚。例如CPS能够以不依赖MyD88方式特异性诱导产生 MCP－1［14］。Segura 等［15］人采用小鼠巨噬细胞模型，发现SS2与细胞共刺激后可产生促炎症细胞因子IL－6和TNF－α，且对细菌浓度和时间有依赖性，并发现SS2纯化的EF和SLY致病因子不能刺激细胞因子的释放。Dominguez－Punaro等［16］在老鼠体内感染SS2 24 h后观察到高水平的全身性细胞因子 TNF－α、IL－6、IL－12、IFN－γ 及趋化因子 CCL2/MCP－1、CXCL1/KC 和 CCL5/RANTE，认为这是动物早期突然死亡的原因。Vanier等［17］认为SS能够诱导炎性介导加剧释放而导致白细胞大量积聚并释放炎性介质;但是SS可调控这种反应，通过积极降低趋化因子和延缓嗜中性粒细胞积聚至炎症部位，以提高其存活能力。

猪链球菌2型无论是体内还是体外刺激炎症相关细胞因子产生，都是一个复杂的、受多种因素影响的过程。寻找一个适当的试验模型和研究方法，对了解该菌体内和体外感染机制是十分重要的。多国学者试图通过研究体内或体外相关细胞因子(主要炎症相关细胞因子)的变化，来进一步了解SS2的致病机制。但目前对SS2真正的致病机制仍未有一个明确的定论，需要继续研究，以便对该病原菌的预防和治疗提供有效的策略。

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