棉花草甘膦抗性基因CP4-EPSPS的初步定位

刘吉焘， 马晓杰， 狄佳春， 陈旭升

(1.南京农业大学农学院，江苏 南京 210095;2.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室，江苏 南京 210014)

(责任编辑:汪恒英)

棉花是重要的经济作物，中国是产棉大国，棉农因防除棉田杂草每年都需付出大量的人力与物力。草甘膦是一种性能良好的除草剂，具有广谱除草和土壤中迅速降解的优点［1-3］，是棉田使用最普遍的除草剂之一。但草甘膦作为除草剂也具有弊端，由于具有广谱除草，即非选择性除草的效能，故在杀死杂草的同时也会给棉花带来伤害。基于此，为了更好地利用草甘膦，抗草甘膦棉花便应运而生。抗草甘膦棉花品种最早出现于1997年，由美国孟山都(Mansanto)公司推出［4］。他们从土壤农杆菌变种CP4中分离到编码抗草甘膦酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)的基因，并通过农杆菌介导法转化珂字棉312(Coker312)，把该基因导入棉花植株，从而使棉花对草甘膦产生抗性［5］。种植抗草甘膦棉花，极大地提高了棉田化学除草的灵活性和机动性，喷药时间不受土壤湿度和天气情况的限制，杂草随时可治。

本试验所采用的抗草甘膦品系G-6是江苏省农业科学院棉花遗传育种项目组从种质系PE-14中筛选纯化而来［6］，经刘新民等［7］分子鉴定，确定其基因来源为人工合成的抗草甘膦基因CP4-EPSPS。本研究通过SSR分子标记技术对抗性基因CP4-EPSPS进行定位，确定抗性基因的位置，旨在为下一步的基因精细定位，进而深入了解外源基因在染色体中的插入位点机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为抗草甘膦的陆地棉G-6和不抗草甘膦的海岛棉海7124。

1.2 试验方法

1.2.1 遗传群体的构建和形态标记调查 以G-6为母本，海7124为父本杂交，收获 F1种子。种植F1，通过自交获得F2种子;F1与G-6杂交得 BC1;F1与海7124杂交得BC2。在江苏省农业科学院实验基地种植亲本和 F1、F2、BC1、BC2群体，种植方式为营养钵育苗移栽，行距为80 cm，株距为40 cm。在大田用0.2%的草甘膦喷洒各群体，调查其抗性株与非抗性株;而后对分离群体进行χ2适合性测验。1.2.2 棉花总DNA提取与PCR扩增 取亲本及F2群体单株幼嫩叶片，DNA提取采用CTAB法［8］。PCR 反应体系为 10.0 μl，包括 20 ng/μl模板 DNA 1.0 μl、2 mmol/L DNTP 1.0 μl、10 × PCR buffer(含mg2+)、10 mmol/L Primer F 0.6 μl、10 mmol/L Primer R 0.6 μl、5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.1 μl、ddH2O 5.7 μl。PCR反应在PTC-200(MJ research)上进行。PCR反应程序为:94℃预变性2 min;94℃变性40 s;56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环;最后72℃延伸7 min［9-10］。扩增产物在8.0%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上电泳。电泳缓冲液为1×TBE，200 V恒压电泳。电泳结束后，参照张军等［11］方法进行染色。

1.2.3 抗草甘膦目的基因的分子检测 利用特异引物F:5'-CCATCCTCTACTGCTTTCCC-3';R:5'-GTCTCACCTTCATCGCCATC-3'［12］进行 PCR 扩增，检测F2群体中各单株的抗草甘膦目的基因。在恒压90 V条件下，使用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，最后在荧光灯下观察目的片段。

1.2.4 差异标记筛选与目的基因定位 在F2群体中随机选取抗性植株和不抗植株各10株，每单株取等量叶片，将抗性单株和不抗单株的叶片分别混合，提取总DNA作为近等基因池［13］。利用本实验室前期从1 350对引物中筛选获得的分布于棉花26对染色体上的234对SSR核心引物［14］，先筛选F2近等基因混池以及两亲本间的多态性差异标记，而后检测F2群体共160个单株的基因型。统计多态性条带，与G-6带型相同的个体基因记为“1”，与海7124带型相同的记为“2”，共显性杂合带型记为“3”，缺失记为“0”。采用Join Map4.0软件进行分子标记的连锁分析和位点排序，确定目的基因在染色体上的位置［15-17］。

2 结果

2.1 抗草甘膦与不抗草甘膦植株的表型特征

草甘膦为内吸传导型慢性广谱灭生性除草剂，主要抑制物体内烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质的合成受到干扰导致植物死亡。大田喷施草甘膦后调查发现，喷施草甘膦10 d后，不抗草甘膦植株顶心开始发黑，叶片从边缘开始枯萎，植株由上至下枯萎直至棉苗整株死亡。而抗性植株则生长正常，没有出现枯萎枯死等现象。

2.2 抗草甘膦性状在海陆杂交群体中的分离规律

调查海陆杂交6个世代群体在大田的抗性分离情况，结果见表1，可以看出:陆地棉抗性亲本G-6全部表现为抗，海岛棉亲本海7124全部表现为不抗。杂交F1代均表现为抗;显性回交群体BC1全部表现为抗;隐性回交群体BC2，其中抗株:不抗株符合1∶1的分离比例;F2代中的抗株:不抗株符合3∶1的分离比例。以上结果表明，抗草甘膦性状是由1对显性基因控制的质量性状。

表1 G-6和海7124杂交后代抗性分离情况Table 1 The segregation of glyphosate-resistant trait in offspring of G-6×Hai 7124

同时，利用特异引物对F2定位群体的单株进行抗性基因分子检测，图1是F2群体部分单株的分子检测结果。由图可见:非抗性单株无PCR扩增条带;抗性单株出现了PCR扩增条带，其扩增长度符合引物设计长度398 bp，显示本研究采用的抗草甘膦棉花品种的抗性基因是人工合成的CP4-EPSPS。

图1 F2群体部分单株的抗草甘膦基因分子检测Fig.1 Glyphosate-resistant gene identification of partial plants from F2population

2.3 CP4-EPSPS基因的分子定位

利用234对核心引物，通过对双亲与F2混池进行差异性标记筛选，共得到27对多态性引物。以这27对多态性引物检测F2作图群体每个单株的基因型，结果得到5个分子标记与目的基因连锁。这5个分子标记分别为 NAU5417、NAU1339、BNL3992、BNL2448、NAU2140，它们都为共显性标记。其中具有代表性SSR引物的PAGE电泳图见图2。

图2 F2作图群体部分单株的PCR扩增图谱Fig.2 PCR amplification profile of partial plants from F2population

查阅Guo等［18］公布的棉花遗传图谱，显示上述5对连锁标记都位于棉花第5染色体上，从而初步推定目的基因CP4-EPSPS在第5染色体上。进一步细筛位于第5染色体上的其他分子标记，共获得15个分子标记与目的基因连锁，而位于目的基因两侧的分子标记分别为 BNL2448、NAU2140(图3)。其中标记BNL2448与目的基因的遗传距离为7.0 cM，标记NAU2140与目的基因的遗传距离为16.2 cM，因此将目的基因定位在棉花第5染色体上。

图3 抗草甘膦基因CP4-EPSPS的连锁图Fig.3 The linkage map of glyphosate-resistant gene CP4-EPSPS

3 讨论

3.1 抗草甘膦基因CP4-EPSPS定位的意义

转基因棉花在国内外已得到普遍推广与应用，但有关外源基因在染色体体上的定位工作鲜见报道。由于海陆杂交F2群体可以获得比较多的多态性标记［19］，因此本研究采用了G-6与海7124杂交F2群体作为基因定位群体。定位结果发现:在棉花染色体5上共有15个标记与草甘膦抗性基因CP4-EPSPS连锁，从而推断目的基因位于第5染色体上。将本研究获得的连锁图谱与Guo等［18］报道的遗传图谱进行比较，发现本研究获得的15对与目的基因连锁的引物，其中12对引物在染色体上的排序与文献中完全吻合，但其中有 3对引物(NAU3014、NAU861、NAU5417)的排序与文献中有所错位。这可能是本试验采用的定位群体与Guo等并不完全相同所致。

CP4-EPSPS是人工合成的一种抗草甘膦基因，对于转基因作物，外源基因在后代中能否稳定遗传和表达是转基因工作成败的关键。外源基因的拷贝数多少、整合区域碱基组成以及结构特点等对于基因的稳定表达、抑制基因的沉默发生具有重要的影响［20］。本研究将CP4-EPSPS初步定位在第5染色体上，接下来可对该基因进行精细定位，然后利用Tail-pcr等技术来研究该基因的插入热点［21］，分析CP4-EPSPS基因的插入位置及周围碱基的特点，将为下一步探究外源基因在染色体上的定向插入机理奠定基础。

3.2 抗草甘膦棉花的育种应用

目前，草甘膦仍是全球使用最广泛的除草剂。该除草剂价格低廉，遇土后迅速分解，无环境污染;但草甘膦对普通棉花具有较强的杀伤作用，在棉花生长期间使用易产生药害。培育抗草甘膦品种是解决药害最经济、最有效的手段［22-23］。G-6对草甘膦的抗性是受1对显性基因控制的质量性状，因此可通过传统的杂交育种手段，将该基因转育到生产上的主推品种中，培育新一代优质、高产、抗除草剂的棉花新品种。其次，由于该抗性性状受显性单基因控制，可将抗除草剂种质系作为杂交配组的父本，配制抗草甘膦杂交棉新组合。通过苗床喷施除草剂即可进行苗床去杂，还可以在苗期快速鉴定杂交棉的制种纯度，从而降低群体去杂与杂交制种纯度鉴定的成本，显示其在杂种优势利用方面具有广阔的应用前景。

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