甲烷氧化菌群共代谢降解TCE的动力学研究

张丽杰，胡庆梅，邢志林，全学军，赵天涛

(1.重庆理工大学，重庆 400054;

2.北京迪威尔石油天然气技术开发有限公司，北京 100085)

三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)通常被企业用作金属部件、电子部件的清洗溶剂和脱脂剂等，也可作为萃取溶剂、化工原料和织物干洗剂等。我国TCE的使用量很大，2010年TCE的表观消费量已达到15.07万吨，并且在每年持续增加中［1］。TCE应用广泛，在水体、土壤和空气中均能检测到TCE［2－5］。大量研究表明:TCE 具有很强的环境毒性，对大鼠具有致癌作用，在长期暴露下对人体是有害的［6］。美国环境保护署(EPA)在1976年就已将TCE列入“优先控制化合物”和“疑似致癌物质”［7］名单。我国常见污染地下水的有机物有25种，而TCE是最常见的卤代物［8］。

近年来，国内外学者采用不同方法对TCE进行处理［9－15］，主要包括物理修复、化学修复和生物修复三方面。EPA已将空气吹脱法和颗粒状活性碳吸附法确定为治理被TCE污染的地下水和工业用水的最经济的方法。但是，这些方法不能永久地去除有毒污染物，而只是简单地将污染物由一个介质转移至另一个介质。生物修复能将有毒污染物转化为无毒物质，与传统的“抽出－处理”修复方法相比，地下水生物修复可以使清理成本降低50～75%，而与传统的“挖出－焚烧”技术相比，土壤生物修复的花费仅为其十分之一。因此，生物修复是一种具有广阔应用前景、经济且环境友好的修复技术。

微生物降解TCE的代谢机制是近20年的研究热点［16－18］。好氧条件下，甲烷氧化菌、甲苯氧化菌和苯酚氧化菌等微生物可降解TCE。甲烷单加氧酶(MMO)可首先将TCE氧化为环氧化合物，然后在水中开环，生成二氯乙酸、醛基乙酸及一个碳原子的产物(CO、HCOOH)，再进一步被氧化为CO2。总体而言，好氧代谢产物无毒性，且比厌氧还原脱氯的降解速率更快。

本文主要研究甲烷氧化菌群静息细胞(没有外来能源的条件下)对三氯乙烯(TCE)降解的影响，并推导共代谢降解TCE的动力学模型［19］，以期通过动力学参数的求取和分析在理论上深入理解甲烷氧化菌群降解三氯乙烯的能力及对三氯乙烯的亲和力，为工程应用打下基础。

1 实验部分

1.1 实验材料

NMS培养基的组成如下:KH2PO41.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9 g/L，MgSO4·7H2O 0.32 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，微量元素溶液10 mL，蒸馏水990 mL，pH=6.8。微量元素溶液组成如下:ZnSO4·7H2O 0.287 mg/L，MnSO4·7H2O 0.223 mg/L，H3BO30.062 mg/L，Na2MOO4·2H2O 0.048 mg/L，COCl2·6H2O 0.048 mg/L，KI 0.083 mg/L，CaCl2·2H2O 3.5 mg/L。

选取上海老港垃圾填埋场已填埋10年的矿化垃圾。取4 mm筛下和2 mm筛上垃圾颗粒约100 g，置于500 mL血清瓶后具塞密封，用甲烷气体80 mL置换瓶中空气，30℃密闭驯化2周实现甲烷氧化菌的复壮。

1.2 菌种活化及富集

称取矿化垃圾1 g放入100 mL NMS培养基中，置于30℃、160 r/min摇床振荡2 h。静置1 h后得到菌悬液。取菌悬液2 mL作为种子接入分装了20 mL NMS培养基的100 mL血清瓶中，用内衬硅胶/聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封。用20 mL甲烷气置换瓶内20 mL空气，然后在30℃、160 r/min条件下振荡培养3～5 d。

将处于指数生长期的菌液转移至10 mL的离心管中，使用低温离心机进行离心(温度3～5℃，转速3000 r/min，时间为5 min)。在无菌操作间倒掉离心管中上清液，加入灭过菌的NMS培养基清洗菌液，然后再进行低温离心，在无菌操作间中倒掉上清液。富集的甲烷氧化菌液中无甲烷，处于静息状态，备用。

1.3 分析测试

采用气相色谱SC－6000A(配ECD检测器)检测三氯乙烯浓度。色谱柱:GDX－1 042 m;氮气为载气，载气流速:35 mL/min;尾吹气速:10 mL/min;进样器(汽化室)温度:120℃;柱箱温度(柱温):80℃;检测器温度:200℃;进样量:0.1 mL;基流补偿0.00 nA。

1.4 甲烷氧化菌群降解TCE的动力学模型

所谓共代谢就是指原本不能被代谢的物质在外界提供碳源和能源的情况下被代谢的现象。其中外界提供的能源称为一级基质，用于微生物细胞增长，并为微生物细胞活动提供能量。被共代谢的物质称为二级基质，不用于微生物细胞增长，也不能为微生物细胞活动提供能量。

在模型推导过程中做如下假设:将甲烷氧化菌群利用甲烷(一级基质)进行增殖培养，至其指数期后利用静息细胞降解卤代烃;卤代烃是二级基质，既不能作为碳源也不能作为能源。在降解过程中，菌体浓度基本保持不变，即CX为一常数。基于以上假设，单底物酶催化反应的动力学特性往往服从Michael-Mentonno模型，可用于描述TCE的代谢，即:

式(1)中:rs为 TCE 的降解速率(mg/min);qs，max为TCE最大比消耗速率，即单位时间内单位质量菌体降解TCE的质量(min－1);KS为半饱和常数，其值大小表征细胞与底物的亲和作用(mg/L);CX为菌体浓度(mg/L);CS为TCE浓度(g/L)

用L－B双倒数法可求取qs，max和Ks。对于分批操作采用time-step法处理实验数据，具体如下:式(1)两边同时除CX并取倒数得:

根据提供的实验数据，在很短的实验时间间隔内，式(2)中rs可近似表示为

Cs取Δt范围内的平均值，即，X基本上不变，为常数，则式(2)为:

2 结果及讨论

2.1 菌体干重与菌液吸光度的线性拟合

将装有100 mL MS液体培养基的血清瓶加入5 mL混合菌液，抽取100 mL空气，再充入100 mL甲烷，进行恒温震荡培养(30℃、160 r/min)。培养一天后抽取菌液在600 nm波长下测吸光度，间隔30 min。同时将5 mL菌液放入培养皿烘干至恒重，得到干重质量。每组实验进行2～3次，确保平均误差小于5%。由图1可知:混合菌浓度CX吸光度OD600nm线性关系很好，可决系数达到了0.993 1。线性方程为 y=2.934x+0.0436，式中 x是菌液吸光度OD600nm，y是菌体浓度CX，单位为g/L。经过活化和富集的混合菌液OD600nm=0.574±0.001。由图1可知富集后的混合菌液浓度为1.728 g/L。

图1 混合菌液吸光度与菌体浓度拟合

2.2 甲烷氧化菌群对TCE的降解效果

将10 mL TCE加入120 mL灭菌的去离子水中，再加入玻璃珠振荡，静止10 min后，抽取饱和TCE溶液。取装有100 mL菌液的血清瓶加入上述饱和TCE溶液1 mL，25℃下放置4 h，使TCE达到气液平衡。然后加入10 mL菌液(CX=1.728 g/L)，顶空取样后利用气相色谱ECD检测TCE的浓度变化，由亨利定律可换算得到TCE的液相浓度［20］。每组实验进行2～3次，确保平均误差小于5%，对照组不加入菌液。TCE随时间变化的降解曲线如图2所示。。

图2 TCE随时间变化的降解曲线

由图2可见:甲烷氧化菌群的静息细胞在6 h内将初始浓度为45.5 mg/L的 TCE降解至9.5 mg/L，降解总量达到了3.6 mg，降解率达到79%。

2.3 甲烷氧化菌群降解TCE的动力学推导

根据时间步长法推导动力学模型方程，在实验中得到如表1所示的数据。表中:Csg表示血清瓶中气相TCE的浓度，单位为mg/L;CsL表示血清瓶中液相TCE的浓度，单位为mg/L，根据25℃亨利系数 H 为1.04×10－3(MPa·m3/mol)换算得到［20］;ΔCsL表示在测量间隔内两次 TCE的浓度差，单位为mg/L;表示在测量间隔内底物TCE的平均降解速率，单位为mg/(L·min);Δt为测量时间间隔，单位为min;表示测量时间间隔内底物TCE的平均浓度，单位为mg/L。

表1 甲烷氧化菌群菌降解TCE动力学数据

根据图3可看出CX/rs－1/CS的线性关系良好，可决系数 R2=0.961，说明 TCE降解符合Monod方程。由方程的截距和斜率，再根据图3可以求出 qs，max=1.51 ×10－4min－1，KS=2.58 mg/L，其降解动力学方程为:对于前期报道的甲烷氧化菌OB3b，当TCE初始浓度为0.66～32.9 mg/L时，半饱和常数 KS为 19.1 mg/L［21］;初始浓度为0.06 ～8.0 mg/L 时，半饱和常数 KS为 10.8 mg/L［22］。通过比较可知，本实验所用的甲烷氧化菌群的半饱和常数KS是1.5 mg/L(TCE初始浓度为45.5 mg/L)，明显小于OB3b菌，说明该甲烷氧化菌菌群对TCE有更强的亲和力，且转化总量高，可达到 3.6 mg，而 Lisa［16］报道的甲烷氧化菌群最大转化总量仅为0.4 mg/瓶。

图3 氯代烃降解动力学拟合

3 结束语

在甲烷、甲醇、乙醇、苯酚等碳源和能源同时存在的情况下，甲烷氧化菌可以利用甲烷单加氧酶共代谢降解氯代烃，这对被氯化物污染过的土壤、地下水或空气来说具有重要意义。共代谢动力学很复杂，且受到底物、产物的数量和浓度以及它们之间的抑制竞争关系等因素影响。在共代谢过程中会不可避免地发生副反应，产生对微生物有害的物质，从而降低氯化物的降解速率。探讨共代谢过程中影响降解速率的动力学参数因素，研究其动力学规律对修复被氯化物污染的工业产物具有重要的意义。

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