乌贼墨多糖的体外抗氧化作用

罗萍，师莉莎，刘华忠

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学生物化学中心，广东 湛江 524088）

我国传统中医药对乌贼墨悠远的医用史实要追溯到《神农本草经》，“可收敛止血，固精止带，制酸定痛，除湿敛疮”。《本草拾遗》描述乌贼“腹中墨，主治血刺心痛”。现代大量的研究结果证实，乌贼墨是一种多功能海洋活性物质，如止血[1]、抗肿瘤[2]、抗菌[3]、抗辐射[4]、升白[5]、抗氧化[6-9]，等。笔者所在实验室对乌贼墨的化疗保护作用进行了大量的研究工作，发现乌贼墨对化疗药物环磷酰胺致模型动物多种正常组织损伤均具有较强的缓解效应。乌贼墨是一种黑色混合物，其中主要成分为糖类、蛋白质、脂类等有机大分子和游离氨基酸、黑色素等有机小分子，除此，墨中还含有多种微量元素。因此，我们对前期研究对乌贼墨中发挥化疗保护作用的有效成分进行了筛选，发现乌贼墨多糖便是活性成分之一。

对乌贼墨多糖的研究，最早见于日本研究人员的报道。日本学者率先对乌贼墨多糖的组成与结构进行了探讨，他们的研究结果表明，多糖链为带有分支结构的糖胺聚糖（GAG），主链为葡萄糖醛酸—海藻糖（GlcA-Fuc）二糖单元的串联重复，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）分支于海藻糖，完整的三糖重复单元为{-3GlcAβ1-4（GalNAcα1-3）Fucα1-}n[10]，该结果被我国的研究人员再次确证[11]。目前，对乌贼墨多糖活性研究的报道十分鲜见。我们近年来的研究发现，乌贼墨多糖是乌贼墨中发挥化疗保护作用的主要成分，能显著缓解环磷酰胺对模型动物造成的毒性损伤[12]。环磷酰胺的细胞毒性原因之一，是因为环磷酰胺在肝脏的代谢产物所诱导的氧化应激所致。在我们前期的研究中，乌贼墨多糖能显著弱化环磷酰胺所介导的氧化性损伤，提升机体的抗氧化能力[12]。因此，乌贼墨多糖的化疗保护效应与其弱化环磷酰胺诱导的氧化应激有关。为进一步探讨乌贼墨多糖的抗氧化作用，本试验检测了乌贼墨在体外的抗氧化能力。研究结果将为促进乌贼墨在保健功能食品领域的研究与开发提供有效的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

乌贼墨多糖为本室制备[13-14]。

乙二胺四乙酸二钠：广州化学试剂厂；铁氰化钾：天津市巴斯夫化工有限公司；邻苯三酚、DPPH：上海华蓝化学科技有限公司；WFZ UV-2800 AH 型紫外分光光度计：尤尼柯仪器有限公司。

1.2 总还原力测定[15]

待测样品、磷酸缓冲液（PBS，pH6.6，2.5 mol/L）和1%K3Fe（CN）6溶液各取2.0 mL 混合，50 ℃水浴20 min，冰水冷却后加入2.0 mL 三氯乙酸溶液（10%，TCA）混匀。3 000 r/min 离心10 min 后取上清2.0 mL，依次加入蒸馏水2.0 mL、0.1%FeCl3溶液0.4 mL，混匀静置10 min。蒸馏水参照，测定A700nm。

1.3 羟自由基清除力测定[16]

取3.0 mL Tris 缓冲液（0.15 mol/L，pH8.2）、1.0 mL溴邻苯三酚红（1 mmol/L） 和1 mL EDTA-Na2-Fe（1.0 mmol/L）混合，再加入多糖试样1.0 mL，最后加入1.0 mL 2%H2O2，混匀后放置30 min。空白以蒸馏水代替试样，对照组以蒸馏水代试样和EDTA-Na2-Fe，测定A520nm。清除率=（A空白－A样液）÷A空白×100%。

1.4 DPPH 自由基清除力测定[17]

取2.0 mL 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼溶液（0.2 μmol/L，DPPH）与2.0 mL 样品混合均匀，在黑暗中放置30 min，测定A517nm。清除率=[（Ac-Ai）/Ac]×100 %（Ac：无水乙醇+DPPH 溶液的吸光度；Ai：待测液+DPPH 溶液的吸光度）。

1.5 总抗氧化能力测定[17]

标准曲线：取6.08 mg FeSO4溶于适量的水中，加入H2SO4（18 mol/L）0.25 mL，再用蒸馏水定容至50.0 mL，并置入小铁钉。取上述溶液5.0 mL，蒸馏水定容至50.0 mL，即为800 μmol/L FeSO4标准溶液。蒸馏水倍比稀释标准溶液，制备400、200、100、50、25 μmol/L 标准溶液，测定A593nm，绘制标准曲线。

总抗氧化能力测定：取0.3 mL 样品加入2.7 mL 预热至37 ℃的三价铁还原抗氧化能力（FRAP）工作液，混匀放置10 min，测定A593nm。样品分别作1、2、5 倍3个稀释度，以无水乙醇代替样品加入FRAP 工作液作为空白，每个稀释度做10 次平行试验，求平均值。根据反应后吸光值，计算相应FeSO4的浓度（μmol/L），定义为FRAP 值。

1.6 数据分析

2 结果与分析

2.1 乌贼墨多糖对DPPH 自由基的清除作用

DPPH 是一种稳定的有机自由基，其稳定性源于苯环的空间障碍，使处于中心部位的氮原子上孤电子不能成对。基于DPPH 的单电子在517 nm 处有一强吸收，且其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于单电子配对而使吸收逐渐衰减，褪色程度与接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。因此，DPPH 法自1958 年建立以来，广泛用于测定生物试样和食品的抗氧化能力。本研究采用DPPH 法测定了乌贼墨多糖体外对DPPH自由基的清除能力，检测数据详见图1。

图1 SIPG 对DPPH 自由基的清除能力Fig.1 Scavenging rates of SIPG at the indicated concentrations against DPPH free radicals

结果表明，在所设定的质量浓度范围内，对DPPH自由基的清除能力与乌贼墨多糖的浓度呈现剂量依赖关系，随着乌贼墨多糖浓度的等量递增，DPPH 自由基的清除率逐渐上升，当质量浓度达到所定最大值（14.25 mg/mL）时，对DPPH 自由基的清除能力也达到最大值。各质量浓度间均有极显著差异（P<0.01）。

2.2 乌贼墨多糖的总抗氧化能力

FRAP 法是一种简便快捷的测定样品总抗氧化能力的方法。其原理是在酸性条件下，抗氧化物可以还原Fe3+-TPTZ（Ferric-tripyridyltriazine） 产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593 nm 测定蓝色的Fe2+-TPTZ 即可获得样品中的总抗氧化能力。由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。由于样品中Fe3+或Fe2+的总量常低于10 μmol/L，因此样品中Fe3+或Fe2+不会明显干扰FRAP 法的检测反应。另外，反应体系中的Fe3+或Fe2+是和TPTZ 螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。FeSO4标准曲线及SIPG 总抗氧化能力，见图2、图3。

图2 FeSO4标准曲线Fig.2 Standard curve of ferrous sulfate

图3 SIPG 总抗氧化能力Fig.3 Total antioxidation capacity of SIPG at the indicated concentrations

由图2、图3 可知，在试验设计的质量浓度范围内，乌贼墨多糖总抗氧化测试混合液的FRAP 值随着质量浓度的增加而迅速增大，当多糖的质量浓度上升至设定最大值时，测试液的FRAP 值增大到最大值57.43，此时，多糖的总抗氧化能力最大。结果表明，乌贼墨多糖在所给定的质量浓度范围内具有较强的抗氧化能力，其总抗氧化能力呈现正向量效关系，质量浓度每增加2.25 mg/mL，总抗氧化能力均会出现显著性增强（P<0.01）。

2.3 乌贼墨多糖对羟基自由基的清除能力

羟自由基是自由基中最强氧化剂，几乎可以与任何大分子作用，导致机体受损和基因突变，引起机体衰老和癌症的发生。本试验利用Fenton 反应测定乌贼墨多糖对Fe2+催化H2O2产生羟基自由基的清除能力。由于羟基自由基可使溴邻苯三酚红褪色，所以根据褪色程度用比色法测定羟基自由基含量。根据此原理，我们可间接评价抗氧化剂的抗氧化能力。本实验对羟自由基的清除能力的检测结果（图4）类似于上述DPPH 自由基和总抗氧化能力的变化规律。在所设定的乌贼墨多糖的质量浓度范围内，随着浓度的递增，其对羟自由基的清除能力也逐渐增强，依然呈现正向量效关系，而且，每增加一个浓度梯度，乌贼墨多糖对羟自由基的清除能力就出现一次显著性上升（P<0.01）。该结果表明，乌贼墨多糖能有效的清除反应体系中的羟自由基，发挥其抗氧化作用。

图4 SIPG 对羟基自由基的清除能力Fig.4 Scavenging rates of SIPG at the indicated concentrations against hydroxyl free radicals

2.4 乌贼墨多糖的体外还原力

Fe3+获得待测物质所提供的电子而被还原为Fe2+，从而使得反应体系的颜色发生改变，表明体系中氧化还原状态变化，体系的吸光值增大，说明被测物质的还原力越强，抗氧化能力越强。因此，利用此原理可检测乌贼墨多糖的还原能力。SIPG 还原能力见图5。

图5 SIPG 的还原能力Fig.5 Reducing power of SIPG at the indicated concentrations

由图5 可知，随着乌贼墨多糖质量浓度的增加还原力逐渐增强，在所选浓度范围内，乌贼墨多糖浓度为14.25 mg/mL 时，还原力最强，正向量效关系明显。差异显著性分析表明，各相邻质量浓度间均具有明显的数据差异（P<0.01）。

3 结论

本实验从对羟自由基和DPPH 自由基的清除能力，以及总抗氧化能力和还原能力等四个抗氧化指标综合评价了乌贼墨多糖的体外抗氧化能力。结果表明，在体外环境中，乌贼墨多糖抗氧化力明显。该结果与本课题组前期完成的体内抗氧化能力检测结果一致。我们的前期研究发现[12]，乌贼墨多糖能较大范围内弱化化疗药物环磷酰胺对机体所造成的氧化性损伤，提升化疗模型动物正常组织器官的抗氧化能力，减低化疗给正常机体所造成的毒副作用。由此可见，乌贼墨多糖或许可作为肿瘤临床治疗中使用的细胞保护剂的候选药物进行开发，必将具有重要的经济与社会效益。

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