乳酸菌降解亚硝酸盐的发酵条件研究

顾诗雯，何婷婷，2，丁少南，2，龚钢明，*

（1.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234）

乳酸菌有促进营养分解、吸收，抑制肠道腐败菌生长，调节肠道微生物菌群平衡降胆固醇，降血压，抗肿瘤等保健功能，是人体健康的益生菌，在传统食品及功能性食品加工中有着广泛的应用。乳酸菌在发酵过程中还可产生一些特殊酶系[1-2]，例如亚硝酸盐还原酶，它可以催化亚硝酸盐还原。食品中如果亚硝酸盐残留超标可存在致癌的危害，当前，由于大量含氮化肥使用以及工业废水的排放与灌溉，使不少蔬菜中亚硝酸盐残留污染较高。利用乳酸菌控制食品中亚硝酸盐残留超标已引起研究者关注。张庆芳等[3-4]对乳酸菌降解亚硝酸盐机理的研究认为乳酸菌发酵产生的乳酸及亚硝酸还原酶都能起着降解亚硝酸盐的作用。夏岩石等[5]比较了自然发酵与乳酸菌接种发酵豆角过程中降解亚硝酸盐的动态，分析了不同发酵温度和起始pH 条件下发酵液亚硝酸盐含量的变化。周光燕等[6]研究了乳酸菌对泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量变化。研究结果都表明乳酸菌有明显降解亚硝酸盐的效果。

乳酸菌发酵降解亚硝酸盐的影响因素较多，例如菌种、接种量、发酵温度、起始pH、发酵时间、培养基成分等。目前，相关的研究还比较少。本文以番茄汁作为培养基，采用正交试验设计研究番茄汁与水的比例，NaCl 添加量，培养时间，所接菌种与亚硝酸盐降解的关系。实验结果对于乳酸菌发酵蔬菜汁工艺中亚硝酸盐残留的控制与消除提供一定技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料及设备

材料：番茄（市售）；酪蛋白胨；牛肉膏；酵母粉；葡萄糖；均为生化试剂，购于国药集团化学试剂有限公司，乙酸钠；柠檬酸二胺；吐温80；K2HPO4；MgSO4·7H2O；MnSO4·H2O；CaCO3；琼脂；硼酸钠；乙酸锌；亚铁氰化钾；盐酸萘乙二胺；对氨基苯磺酸；亚硝酸钠均为分析纯购于国药集团化学试剂有限公司。

PHSJ-4A 型PH 计：上海大中分析仪器厂；HH-S型水浴锅：金坛市岸头国瑞实验仪器厂；SYQ-DSX-280 型灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SHP-150 型CO2恒温培养箱：上海精宏设备有限公司。

菌种：短乳杆菌（Lactobacius brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）由上海应用技术学院香料香精技术学院分离并保存。

1.2 培养基

MRS 液体培养基：酪蛋白胨10.0 g；牛肉膏10.0 g；酵母粉5.0 g；葡萄糖5.0 g；乙酸钠5.0 g；柠檬酸二胺2.0 g；吐温80 1.0 g；K2HPO42.0 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；MnSO·4H2O 0.05 g；CaCO320.0 g。去离子水：1 000 mL，调节pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min（pH 测定采用PHSJ-4A 精密pH 计）。

番茄汁培养基：取新鲜番茄，洗净，于95 ℃水中热烫3 min，去皮，用组织捣碎机打浆，用2 层纱布过滤，所得滤液与适量蒸馏水混合后即得到番茄汁，与一定比例的蒸馏水混合，调节pH 至6.5，再加热至90 ℃保持30 min，得番茄汁培养基，冷却后备用。

1.3 菌种活化与培养

取菌种按4%接种量接种于装有200 mLMRS 液体培养基250 mL 锥型瓶中，置培养箱，37 ℃培养20 h，得到种子菌种，备用。

1.4 番茄汁发酵培养

取250 mL 锥型瓶中加入200 mL 番茄汁培养基，再加入一定量的NaCl，接入相应的菌种，接种量为4 %，放置恒温培养箱，37℃培养20 h，取出调pH 至6.5，加入一定量NaNO2，37 ℃发酵培养一定的时间，取样测定NaNO2的量。

1.5 NaNO2标准曲线建立

称取0.100 g 亚硝酸钠于干燥器中干燥24 h，置入500 mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混匀后从中取出5.00 mL，置于200 mL 容量瓶中，加水蒸馏水至刻度，得亚硝酸钠母液。分别吸取亚硝酸钠母液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 置 于50 mL 容量瓶中，各加入40 mL 蒸馏水，和2 mL 对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置5 min，再各加入1 mL 盐酸萘乙二胺溶液，混匀后加水至刻度，避光静置15 min，于540 nm 处测吸光值。以横坐标为NaNO2的含量，纵坐标为吸光值，制作标准曲线[7]。

1.6 样品测定

取5.0 mL 发酵液，置于250 mL 三角瓶中，加入12.5 mL 饱和硼砂液，搅拌均匀，再加入40 mL 蒸馏水，沸水浴加热15 min，冷却至室温后加入5 mL 亚铁氰化钾溶液，混匀后加入5 mL 乙酸锌溶液，混匀，静置30 min，转入100 mL 容量瓶中，加水至刻度，混匀。过滤，收集滤液。取2.00 mL 滤液于50 mL 容量瓶中，加入40 mL 水，再加入2 mL 对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置5 min，再加入1 mL 盐酸萘乙二胺溶液，混匀，加水至刻度，避光静置15 min，在540 nm 处测吸光值，另以5.0 mL 蒸馏水代替样品液，做空白对照。根据标准曲线求得样品NaNO2的含量[7]。

1.7 正交试验设计

根据预实验，选NaCl 添加量、番茄汁∶水、培养时间、乳酸菌菌种为影响因素，以亚硝酸盐降解率为指标，进行正交试验。每个因素选择3 个水平，用L9（34）正交表设计进行实验。因素水平见表1。

表1 正交试验因素和水平表Table 1 orthogonal factors and levels table

乳酸菌发酵液中NaNO2降解率按以下公式计算：

NaNO2降解率=（初始培养时NaNO2的含量-培养一定时间后NaNO2的含量）/（初始培养时NaNO2的含量）×100%

1.8 验证实验

按照正交试验选择的最佳提取工艺条件，重复进行3 次发酵实验，并测定亚硝酸盐降解率，评价正交试验选择的工艺条件是否稳定。从而得到最优化的发酵条件组合。

2 结果与讨论

2.1 NaNO2标准曲线

根据1.5 实验数据，绘制NaNO2标准曲线，求得曲线方程为：

2.2 正交试验

按照表1 正交设计因素水平表进行乳酸菌番茄汁发酵。检测NaNO2含量变化求得NaNO2降解率。试验结果见表2。

极差分析结果表明，各因素对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响程度从高到低的次序为B＞C＞D＞A，即NaCl添加量＞培养时间＞菌种＞番茄汁∶水。最佳发酵工艺条件为A2B2C2D3。即NaCl 添加量4%，培养时间18 h，接菌种为4%植物杆菌，番茄汁∶水为1 ∶1 的条件。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

由从表2 可以看出NaCl 的添加量对于番茄汁发酵产亚硝酸盐还原酶的量有显著影响，这可能是因为Na+的存在与亚硝酸盐还原酶的活性有一定关系，但是NaCl 浓度不能过高，否则会降低NaNO2的降解率，这与张庆芳等的文献报导相符[8]。关于NaCl 对乳酸菌具体情况需要进一步研究。

2.3 验证实验

根据正交试验选择的最佳发酵条件，即A2B2C2D3的组合重复3 次实验，验证实验结果是乳酸菌番茄汁发酵对NaNO2的平均降解率为92.08 %。

3 结论

本实验采用正交设计法，以番茄汁为培养基，研究了番茄汁与水比例、NaCl 添加量、培养时间、发酵菌种对乳酸菌发酵降解亚硝酸盐的影响。实验确定了各因素次的主次顺序为NaCl 添加量＞培养时间＞菌种＞番茄汁∶水。最佳发酵工艺条件是NaCl 添加量4%，培养时间18 h，菌种为的短乳杆菌，接种量4%，番茄汁∶水为1 ∶1。在此条件下进行了3 次重复实验，结果显示乳酸菌番茄汁发酵对NaNO2的平均降解率为92.08%。本实验结果为深入研究乳酸菌降解亚硝酸盐的发酵条件及探索纯种发酵蔬菜汁工艺提供参考。

[1]杨洁彬等.乳酸菌的生物学基础及应用[M].北京：中国轻工业出版社,1996：4-10

[2]龚钢明,吕玉涛,管世敏,等.乳酸菌亚硝酸盐还原酶制备及酶学性质[J].中国酿造,2011,31(1)：58-60

[3]张庆芳,迟乃玉,郑艳,等.乳酸菌降解亚硝酸盐机理的研究[J].食品与发酵工业,2002,28(8)：27-31

[4]张庆芳,迟乃玉,郑学仿,等.短乳杆菌去除亚硝酸盐的研究[J].微生物学通报,2004,31(2)：55-60

[5]夏岩石,孙春凤.乳酸菌降解亚硝酸盐的动态研究[J].湖南科技学院学报,2008,29(8)：44-46

[6]周光燕,张小平,钟凯,等.乳酸菌对泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量变化及泡菜品质的影响研究[J].西南农业学报,2006,19(2)：290-293

[7]中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.33－2003.食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定[S].北京：中国标准出版社：259-265

[8]董硕,迟乃玉,张庆芳.氯化钠对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响[J].中国酿造,2010(7)：103-105