P物质在慢性中耳炎肉芽及纤维组织中的表达及意义

西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉科（西安710004） 孙 斌 成 颖 许 珉

慢性中耳炎以肉芽组织形成为标志，中耳粘连、听骨破坏、鼓室硬化等顽固性病变与肉芽组织有关，因此对肉芽组织形成因素和病理行为的研究，是理解中耳炎病理的关键。P物质（SP）是神经源性炎症中的一个重要介质［1］，趋化炎性细胞产生炎症反应，并且促进成纤维细胞的增殖，与肉芽组织的形成相关。本研究选取慢性中耳炎患者中耳组织标本，通过免疫组织化学技术，检测SP在中耳炎性肉芽组织中的表达，探讨SP在肉芽组织形成及转化中的作用，揭示神经源性炎症对中耳炎性病变的影响，为认识中耳炎的病变过程及发生、发展和转归提供依据。

对象与方法

1 对 象 收集我院接受中耳手术治疗的慢性中耳炎患者70例，均不伴胆脂瘤形成，男32例（32耳），女38例（38耳）；年龄6～78岁，平均33．6岁；左侧33耳，右37耳；病程13月至45年，平均12．45年。获取10例外耳道正常皮肤组织作为对照。

2 方 法 术后立即用10%甲醛固定，常规石蜡包埋。选用兔抗人SP多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物公司（ZA－0235）。检测方法按照产品说明书过程进行。石蜡切片5μm脱蜡至水，显色剂显色，苏木素复染、封片，显微镜观察、计数并摄像。以正常外耳道皮肤作为阴性对照。

3 统计学处理 采用SPSS16．0统计软件包分析，对不同病变程度患者SP表达情况用行×列表的χ2检验及线性回归分析；对SP在肉芽组织及纤维组织中表达对比用秩和检验（Wilcoxon两样本比较法），P＜0．05有统计学意义。

结 果

1 SP的表达 阳性对照呈明确的黄色或棕黄色染色；正常外耳道皮肤阴性对照呈淡黄色，为弱阳性。肉芽组织中SP要定位于肉芽组织中的炎性细胞（淋巴细胞、单核巨噬细胞、浆细胞）、成纤维细胞和血管壁的细胞浆中，呈棕黄染色，强阳性为主。纤维组织中定位于胶原纤维、炎性细胞、成纤维细胞和血管壁的细胞浆中，染色以黄色为主，部分标本染色较弱。

2 病例资料分级 根据术前检查、术中观察及术后病理检查所见，依据肉芽在中耳的增生程度，将标本分为四级：一级，中耳腔无可见肉芽，黏膜轻度增厚，听骨链完整，活动可，患者平均听阈≤30d B；二级，中耳腔肉芽仅侵及中耳鼓室、乳突、鼓窦、鼓窦入口及后鼓室等中的一个解剖区域，且听骨链完整，活动可，患者平均听阈31～40d B；三级，肉芽侵及两个解剖区域，且听骨链活动差，患者平均听阈41～50d B；四级，肉芽侵及两个以上解剖区域，或外耳道肉芽，听骨链固定或中断，患者平均听阈＞50d B。各级标本对应的SP表达情况（见表1）。对中耳病变轻重程度与SP表达的关系行χ2检验及线性回归分析（见表2）得出P＜0．05，即SP与中耳病变级别存在相关关系，且为线性关系。即级别越高，病变越重则SP表达越强。

表1 肉芽组不同病变程度标本SP表达情况

表2 中耳病变轻重程度与SP表达的关系分析

3 SP在肉芽组织与纤维组织中的表达 见表3。肉芽组织50例，纤维组织20例，采用秩和检验（Wilcoxon两样本比较法），μ＝3．4782，肉芽组织组P物质表达高于纤维组织组（P＜0．05）。

表3 SP在肉芽组织及纤维组织中表达情况

讨 论

SP是除经典神经递质（乙酰胆碱、单胺类、氨基酸）外的第三类神经活性物质，SP与其受体结合作用于效应细胞，发挥生物学效应。其受体分为 NK1、NK2和NK3三型，SP对NK1受体亲和力较高。按其分布部位和作用方式的不同SP起着神经递质、神经调质或激素样作用。SP能以神经内分泌的方式作用于各种免疫细胞参与免疫调节，促进免疫功能［2］。同时，受各种刺激（物理、化学、生物性）时，SP可逆向性的释放进入局部组织中，组成了神经源SP介人炎症反应的解剖和生理基础。研究表明，低剂量SP能直接作用于血管，而较高浓度时SP可再借助于其诱导产生的其它炎性介质而形成双重效应［3］。导致炎症局部血管扩张、血浆渗出。SP对多型核白细胞、单核巨噬细胞及T淋巴细胞具有趋化性或增强其它趋化因子对这些细胞的趋化作用，将炎性细胞保持在炎症部位，有助于炎症反应的进一步发生。SP能通过释放炎性代谢产物直接影响巨噬细胞的功能。SP可刺激巨噬细胞的聚集、吞噬和趋化［4］，增加炎症调控因子IL－1的释放，强化LPS诱导的IL－6和TNF－α的释放。T淋巴细胞和血管内皮细胞外基质的黏附是使得它们能够渗出血管到达炎症部位发挥作用的关键环节。SP可剂量和时间依赖性提高内皮细胞对T淋巴细胞的黏附力，且可通过T淋巴细胞表达其特异性受体而获得促黏附或抗黏附信号，从而调节 T淋巴细胞的功能［5］。肥大细胞上有神经肽受体 NK1存在［6］，SP与神经肽受体结合后促使肥大细胞脱颗粒释放组织胺、血清素、一氧化氮等，使血管扩张和血浆溢出，而肥大细胞释放的组织胺也可调节SP的水平［7］。在肥大细胞释放的颗粒中含有如 TGF－β、TNF－α、b FGF、IL－1、IL－3、IL－4、IL－6等细胞因子，这些因子参与了炎症反应并可刺激修复细胞迁移、增殖和胶原合成。其中的IL－1、肿瘤坏死因子对成纤维细胞的增生和胶原的合成有双向调节作用［8］，而TGF－β能够促进成纤维细胞增殖，趋化成纤维细胞和巨噬细胞到损伤部位，加速创伤部位纤维化。巨噬细胞也可以通过将抗原呈递给T淋巴细胞，T淋巴细胞释放的淋巴因子IL－2、IL－6和TGF－β具有确定的促进成纤维细胞增殖和胶原沉积的作用。研究表明，SP在体外对肉芽组织成纤维细胞具有显著的促增殖作用［9］，并表现出明显的剂量依赖特性。受刺激的成纤维细胞还吸引大量的炎细胞浸润，聚集并产生大量的细胞因子，这些细胞因子反过来又刺激成纤维细胞的增生与分化，并分泌一些细胞外基质成分，由此产生恶性循环，形成肉芽。

渗出液和肉芽是中耳炎患者中耳腔中的常见病变，Sady等［10］颞骨病理切片研究发现肉芽组织在中耳腔的发生率可达97．2%，渗出液的发生可达89．6%；Vikra m等［11］观察150例中耳炎颞骨病理切片发现渗出液和肉芽组织几乎出现在所有慢性中耳炎病理切片中。说明慢性中耳炎最显著的两个病变就是中耳腔渗出液的积聚和肉芽组织的形成，而肉芽组织的形成是慢性中耳炎的特征性不可逆病理改变。慢性中耳炎主要是以肉芽组织形成为标志的，许多象粘连、听骨破坏、鼓室硬化等病变都与肉芽组织有关。SP存在于分泌性中耳炎（SOM）的中耳积液（MEE）中［12］，且浆液性MEE中SP含量明显高于黏液组，MEE中SP浓度越高，作用越持久强烈，其病程发展则愈长。SP可以刺激中耳粘膜腺体，使其增生分泌亢进。Nagaraj等［13］认为中耳腔粘膜在炎症条件下的渗出是一种积极的反应，自主神经和神经肽在中耳炎的病理过程中起着重要作用。

本研究在慢性中耳炎的病理切片中观察到炎性细胞在中耳黏膜下及肉芽中的浸润，炎症细胞主要为淋巴细胞，单核巨噬细胞，也可见少量多核白细胞。同时SP在慢性中耳炎的黏膜中有表达，主要在纤维细胞、炎性细胞、血管上皮及腺体细胞的胞浆中，呈明显的黄色或棕黄染色。这些细胞均存在NK1受体，因此SP的高表达说明了神经炎性介质积极参与了中耳炎性过程，使炎症细胞聚集、部分组织增生，同时产生大量的CK，这些CK又可刺激局部粘膜增生、损伤，吸引炎症细胞在局部聚集，各类CK之间又可相互作用，如IL－1β、TNF－α、γ－INF等均可诱导内皮细胞产生IL－6，IL－6又可抑制TNF－α的产生，TNF－α过高或过低都可导致机体免疫调节紊乱。TNF－α又可以促进IFN－γ的分泌，IFN－γ具有抗病毒和免疫调节的作用，IL－1、TNF－α、LPS又可诱导IL－8的产生，它又可对中性白细胞产生趋化作用。促使着炎性过程进一步发展。

本实验病理标本的肉芽组织中SP呈现了高表达，主要在纤维细胞、血管上皮等的胞浆中，并且SP的表达与病例资料分级存在相关关系，且为线性关系（χ2＝25．9919，ν＝9，P＜0．05），SP表达越强则级别越高。而我们的病例资料分级是以肉芽组织在中耳的增生程度为主要依据，因此，SP表达越强则中耳腔肉芽组织增生越多。说明神经原性炎症的强弱影响着中耳腔肉芽组织的增生程度。受SP趋化的炎性细胞及其分泌的细胞因子等诱导成纤维细胞的增生和胶原的合成，并分泌一些细胞外基质成分，吸引大量的炎细胞浸润，聚集并产生大量的细胞因子，由此产生恶性循环，使纤维母细胞和毛细血管内皮细胞旺盛增生，并以小动脉为轴心，在周围形成袢状弯曲的毛细血管网，与纤维母细胞一起构成小团块，形成了肉芽。张全安等［14］对中耳炎颞骨切片观察显示：咽鼓管黏膜几乎无炎性病理改变；前半－后下中鼓室区病变很轻；听骨链区病变最重；鼓窦－乳突区病变也很重。笔者认为：因为中耳腔前部区域黏膜下缺少神经和血管，不易使由神经肽介导的神经源性炎症反应在中耳黏膜下发生；而中耳腔后部区域黏膜下富于神经和血管，这为SP介导神经源性炎症反应提供了解剖基础，是SP在多方面参与了中耳炎症反应的有力证据。中耳腔肉芽组织逐渐纤维化，病变静止，本实验统计分析肉芽组织组SP表达高于纤维组织组（μ＝3．4782，P＜0．05），说明由SP介导的神经源性炎症反应在中耳腔已经减弱。

SP作为一种具有多方面生理学效应的神经肽，参与了神经炎症反应的全过程。它不仅作为感觉神经上行传导伤害性刺激的物质基础，而且直接或间接作用于成纤维细胞，直接参与到中耳炎的免疫炎症反应和炎性肉芽形成和转归的过程中，并在其中起了十分重要的作用。可以认为SP具有感受和防御各种伤害性刺激，与其它机制共同调节机体平衡，具有非常重要的作用。

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