凝集素组织化学技术在针刺干预脑梗塞后微血管形态学研究中的应用＊

石 磊 杜元灏 黎 波 天津中医药大学第一附属医院（天津300193）

亲合组织化学是利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法，它不同于免疫组织化学，不属于抗原抗体反应，又与组织化学有本质上的区别，因此，Bayer（1976）首次称之为亲合组织化学。凝集素不是来源于或参与免疫反应的产物，但它具有与特定糖基相结合的特性，因而，凝聚素可以作为一种探针来研究细胞上的糖基，特别是细胞膜的微小化合物结构，从而探索细胞的生物学结构和演变过程。这种技术一方面利用凝集素与酶、荧光素、胶体金等标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合形成一种亲合反应，因此，Ponder（1983）提出应称为“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。凝集素染色可采用直接法或间接法［1，2］，目前应用较多的则是糖－凝集素－糖法。

本研究将这一技术应用于针刺干预脑梗塞后微血管形态学变化的实验中，并进一步根据研究要求进行方法调整，现将研究方法及部分实验结果介绍如下。

1 方法 笔者根据Gavin Thurston等的实验方法进行调整［3，4，5］，在脑梗塞急性期血管形态学变化及针刺干预效应研究中，以凝集素组织化学技术对急性期MCAO 大鼠脑血管形态变化进行研究，实验步骤简介如下：①采用Longa的腔内线栓法阻滞大鼠右侧大脑中动脉，复制脑梗塞模型：选择健康雄性Wistar大鼠（北京大学医学部实验动物科学部提供），体重180～200g，随机分为模型对照组和电针干预组，普通层流架系统喂养。②处理方法：电针干预组在MCAO 后即刻针刺人中穴，用15Hz，1mA 的电刺激持续20min；模型对照组和空白对照组均同样抓取固定，但不进行任何治疗。③样本制备：针刺治疗组、模型对照组分别在MCAO 后1、3、6h，于一侧股静脉注射生物素化番茄凝集素（Vector公司，货号：B－1175，100μg／100μL生理盐水），2min后，开胸行心脏灌注，灌注液为1%多聚甲醛与0.5%戊二醛混合PBS缓冲液，130mmHg压力连续灌注5min，取脑，冰冻切片，切片厚度35μm。冷丙酮固定10min，－20℃保存待检。④染色：取冰冻切片，PBS缓冲液洗5min×2，置于PBS缓冲液（含0.3%Triton X－100）中，37℃孵育4h，滴加ABC复合物（Vector公司，货号：PK－4000），37℃孵育1h后，PBS缓冲液洗5min×2，滴加DAB（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI－9032）染色试剂反应15min，彻底水洗终止反应，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2 研究结果

2.1 染色结果 染色结果如图1所示。染色结果显示，凝集素组织化学技术可以比较完整、立体的显示脑组织微血管形态以及脑实质血管分布特征，血管经染色后边缘清楚，与组织背景色彩对比明显，便于计量统计和图像的分析、处理。

2.2 结 果 采用Pro－Plus图像分析系统进行图像采集并导出相应数据进行统计分析，见表1。

表1 MCAO 大鼠梗死塞周围脑血管量比较（±sR，n＝6）

表1 MCAO 大鼠梗死塞周围脑血管量比较（±sR，n＝6）

△表示与空白对照组比较P＜0.001，▲表示与模型对照组比较P＜0.01。

时间空白对照组模型对照组电针干预组317.00±7.40梗塞1h136.20±2.96△ 195.50±5.61△▲梗塞3h130.39±9.58△192.50±10.98△▲梗塞6h130.83±7.97△ 186.28±9.82△▲

梗死塞周围脑血管量统计结果显示：与空白对照组比较，模型对照组在MCAO 后1、3、6h血管量均显著减少，有统计学差异P＜0.001），电针干预组与相对应模型对照组各时相比较，血管量均显著增加，有统计学差异（P＜0.01），但是仍显著少于空白对照组（P＜0.001）。

表2 MCAO 大鼠梗塞区脑血管量比较（±sR，n＝6）

表2 MCAO 大鼠梗塞区脑血管量比较（±sR，n＝6）

△表示与空白对照组比较P＜0.05，◇表示与模型对照组比较P＜0.05

时间空白对照组模型对照组电针干预组152.40±2.50梗塞1h115.80±3.67△ 132.50±5.52△◇梗塞3h116.24±4.28△ 132.40±4.28△◇梗塞6h116.33±3.11△ 129.93±5.98△◇

梗死塞脑血管量统计结果显示：与空白对照组比较，模型对照组在MCAO 后1、3、6h血管量均显著减少，有统计学差异（P＜0.05），电针干预组与模型对照组比较，各时相脑血管数均增加，有统计学差异（P＜0.05），但是，与空白对照组比较仍显著减少，有统计学差异（P＜0.05）。

图1 番茄凝集素对大鼠脑微血管形态研究 DAB染色

3 讨 论 凝集素组织化学已经广泛应用于生物学及医学检验等相关领域，关于凝集素及其应用的研究在国外的文献报道中多见［6，7，8，9］，但在国内鲜有报道，本研究将这一方法应用于脑梗塞急性期血管形态学变化及针刺干预效应研究中，从研究结果可见：凝集素组织化学染色可清晰、完整的显示脑微血管形态，图像对比度明显，便于图像分析、数据提取并更好地保证了分析结果的可靠性。

本研究统计结果显示：电针干预可增加MCAO 模型大鼠梗死区及周围有血流灌注的脑血管量，提示电针干预能够更好的促进脑梗塞急性期侧支循环建立，从而增加脑血流灌注。

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