枸杞多糖对小鼠移植性肝癌抑制作用的实验研究

刘 静 陕西学前师范学院生物科学与技术系（西安710100）

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，目前针对其治疗多采用放疗或化疗法，但这种传统方法无法抑制肿瘤细胞的转移，在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也带来不同程度的损害，多具有一定的不良反应，严重影响患者生活质量，预后较差［1，2］。枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBP）是由枸杞子经脱脂，水提等步骤获得的蛋白多糖。近年来药理研究表明，枸杞多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗突变、抗病毒、抗感染等多种生物活性［3］。其对于癌细胞不具有直接杀伤作用，而是通过中间宿主效应，在多个层面，多条途径上作用于免疫细胞，加强机体免疫功能，增加抗体的分泌，达到抑制或杀伤癌细胞的作用。本研究中将枸杞多糖作用于移植性肝癌的小鼠，探讨枸杞多糖对肝癌的抑制作用。

1 资料与方法 1.1 实验动物与瘤株 昆明种小鼠48只，清洁级，5～7周龄，体质量（18.5±2.4）g，雌雄各半，由吉林省药品检验所实验动物部提供。原发性肝癌H22腹水型细胞株购自中科院药物研究所。

1.2 药物与试剂枸杞多糖购自上海康舟真菌多糖有限公司，批号20110211。环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号110412132。

1.3 仪器 Olympus光学显微镜（日本）；LDZ－5低温高速离心机（北京医用离心机厂）；Airtech 无菌超净工作台（苏州富泰洁净系统有限公司）；96孔培养板（美国COSFT）；TP－100天平（北京赛得利斯）。

1.4 模型制备 将健康小鼠随机分为6组，每组8只：肝癌细胞接种方法为取医用酒精消毒小鼠腋下皮肤，抽取已感染H22瘤株的小鼠新鲜腹水，于小鼠右侧腋窝下接种0.1mL（约含H22瘤细胞4×106个），制备荷瘤小鼠模型。A 组为对照组，未接种肝癌细胞，接种同剂量生理盐水。接种后，腹腔注射生理盐水；B 组为模型组，接种肝癌细胞后，腹腔注射生理盐水；C组为环磷酰胺组，在接种肝癌细胞后注射20mg／kg的环磷酰胺；D 组、E组、F组作为枸杞多糖高、中、低剂量组，接种肝癌细胞后，分别腹腔注射20mg／kg、10mg／kg、5mg／kg的枸杞多糖。

每组分别给药4周，给药结束后以眼球摘除法取血，分离血清，在酶标仪上测定（波长为492nm）血清中TNF－α含量，复孔检查，根据样品OD 值在标准曲线上查出相应的TNF－α含量。

颈椎脱臼处死小鼠，取肿瘤组织，称质量，并将肿瘤组织置于甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，观察病理学改变。

1.5 统计学方法 本研究数据应用SPSS 18.0软件进行统计学数据分析。数据以（±s）表示，多样本均数间比较采用One－way ANOVA 分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 枸杞多糖对荷瘤小鼠TNF－α的影响由表1可知，枸杞多糖高、中、低剂量组（D、E、F组）TNF－α分泌较模型组（B组）相比，有显著性升高（P ＜0.05），表明枸杞多糖对TNF－α分泌有促进作用，可增强直接杀伤或抑制肿瘤细胞的作用。

表1 各组小鼠TNF－α浓度比较（±s）

表1 各组小鼠TNF－α浓度比较（±s）

注：与B组比较，△P ＜0.05

组别例数TNF－α（ug／mL）A 组8 68.61±2.68△B组8 54.38±5.49 C组8 66.69±4.52△D 组8 71.77±5.43△E组8 76.48±3.46△F组8 79.19±3.45△

2.2 各组小鼠肿瘤体积与质量的比较 枸杞多糖高、中、低剂量组（D、E、F 组）与模型组（B 组）相比，肿瘤体积明显缩小，肿瘤质量降低（P ＜0.05）。同时环磷酰胺组肿瘤体积亦有明显减小，抑制肿瘤生长的作用与枸杞多糖高剂量组相比，基本接近，差异无显著性意义。

表2 各组小鼠TNF－α浓度比较（±s）

表2 各组小鼠TNF－α浓度比较（±s）

注：与B组同项指标相比，△P ＜0.05

组别例数肿瘤体积（mm3）肿瘤质量（g）A 组8 0 0 B组8 984.32±47.28 4.68±0.38 C组8 619.47±38.59△2.53±0.54△D 组8 671.79±53.59△2.57±0.59△E组8 726.63±36.42△3.28±0.37△F组8 875.17±38.37△3.94±0.51△

2.3 肿瘤的组织学改变 Olympus 光学显微镜可见，枸杞多糖高剂量组与环磷酰胺组肿瘤坏死程度最为明显，坏死范围最广；淋巴细胞与单核巨噬细胞浸润更为明显，且纤维组织增生也较为明显。枸杞多糖中、低剂量组较模型组相比，肿瘤组织与正常组织交界处亦可见不同程度的淋巴细胞浸润，但纤维组织增生不明显。表明枸杞多糖高剂量与环磷酰胺可抑制癌瘤细胞，生成大量淋巴细胞与巨噬细胞，增强机体免疫功能。

3 讨 论 原发性肝癌是临床常见恶性肿瘤之一，其病死率较高，预后较差。手术切除病灶无法保证切除所有癌变细胞，同时无法控制肿瘤细胞的转移［4］。而手术后的放疗与化疗的使用在杀伤癌变细胞的同时在一定程度上也损害了正常组织细胞，导致骨髓造血功能或免疫功能障碍，带来较多的不良反应。因此开辟新的治疗途径，寻求高效，低毒副作用的治疗方法是目前研究中极为重视的问题。中药治疗肿瘤近年来得到了较大的关注并取得了不错的进展。由于中药毒副作用较低，可调节机体的免疫功能，因此开发中草药在肿瘤治疗中意义重大［5］。

枸杞多糖是枸杞的重要活性成分，经研究表明，枸杞多糖具有免疫调节、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、降血脂、降血糖、清除氧自由基、延缓衰老、抗疲劳等功能。大量的试验结果表明，枸杞多糖诸多功能的发挥源于其对机体的免疫调节作用。其对癌细胞并不具有直接抑制或杀伤作用，而是通过中间宿主效应，即增强机体对癌瘤的免疫功能等途径发挥抑制作用而实现的［6］。枸杞多糖可通过多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用，一方面能激活T、B 淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞，促进抗体的分泌。另一方面通过诱导自然杀伤细胞分泌γ－干扰素，增加巨噬细胞的吞噬功能，并促进白细胞介素与肿瘤坏死因子的分泌，加强机体的体液免疫功能，从而对免疫系统发挥重要的调节作用［7］。

在本研究中，枸杞多糖对荷瘤小鼠中肝癌生长具有明显的抑制作用。枸杞多糖不同剂量组肿瘤重量均低于肿瘤模型组，同时肿瘤体积亦明显低于模型组。癌变部位组织学比较中，枸杞多糖高剂量组与环磷酰胺组的肿瘤坏死程度重且范围广，淋巴细胞与单核巨噬细胞浸润更为明显，且纤维组织增生也较为明显。环磷酰胺作为一种广谱的抗癌药，在杀伤癌细胞的同时也会损伤快速增殖的正常细胞，因此其虽具有明显的抑瘤作用，但不良反应严重。枸杞多糖高剂量组与环磷酰胺对于肿瘤坏死程度的影响疗效相当，但其毒副作用小，因此更适于临床应用，是较为理想的抗肿瘤辅助治疗药物［8］。枸杞多糖对肝癌抑制作用的机制尚不明确，结合小鼠实验研究提示可能与下列机制有关［9，10］：①枸杞多糖可对体液免疫起到调节作用，可提高小鼠淋巴细胞增殖，增加小鼠总T 细胞与T 细胞亚群，是降低的免疫细胞恢复至正常水平，相助增强淋巴细胞的转化率与CTL的杀伤能力；②增强小鼠对单核巨噬细胞的调节，通过处理抗原与释放可溶性因子对抗肿瘤方面起到重要作用。枸杞多糖可增强单核巨噬细胞的吞噬功能，促进巨噬细胞产生TNF，提高胞内溶菌酶与超氧化物歧化酶的活性，进而溶解肿瘤细胞；③枸杞多糖可增加NK 细胞杀伤活性，增加白细胞数量，拮抗NK 细胞的活性降低，提高IL－2因子的场所，维持NK细胞活性；④诱导干扰素产生，促进巨噬细胞的受体与肿瘤细胞表面IgG 结合，发生特异性免疫而杀伤肿瘤细胞。

综上所述，枸杞多糖对肝癌细胞的生长有明显的抑制作用，能有效增强宿主的免疫能力，提高机体免疫杀伤能力。因此，枸杞多糖在抗肝癌药物研发与临床应用上具有广阔的前景。

［1］ 陈 玮，蔡美英，曹伟民，等.PLA 表位肽免疫微球诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用［J］.成都医学院学报，2006，1（1）：12.

［2］ 邵鸿娥，李丽芬，刘斌钰，等.枸杞多糖对小鼠体内抗氧化酶活性及耐力的实验研究［J］.中国自然医学杂志，2010，12（2）：86.

［3］ Miliakova MN，Shabanov VV.Possible mechanism and physio－pathological significance of superoxide dismutase regulation by oxygen free radicals［J］.Biomed Khim，2009，52（2）：130.

［4］ 穆 冰，刘晓峰，熊 进，等.枸杞多糖的急性毒性及致突变性［J］.环境与职业医学，2010，19（3）：201.

［5］ 何彦丽，苏俊芳.中药多糖抗肿瘤免疫药理研究的新思路—对树突状细胞的影响［J］.中国中西医结合杂志，2009，23（1）：73.

［6］ Shi GF，An LJ，Jiang B，et al.Alpinia protocatechuic acid protects against oxidative damage in vitro and reduces oxidative stress in vivo［J］.Neurosci Lett，2009，403（3）：206.

［7］ Bloomer RJ，Goldfarb AH，Wideman L，et al.Effects of acute aerobic and anaerobic exercise on blood markers of oxidative stress［J］.J Strength Cond Res，2011，19（2）：276.

［8］ Ascensao A，Magalhaes J，Soares JM，etal.Endurance training limits the functional alterations of rat heart mitochondria submit－ted to in vitro anoxia－reoxygenation［J］.Int J Cardiol，2010，109（2）：169.

［9］ 朱 杰，赵鲁杭，陈 智.枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响［J］.浙江大学学报·医学版，2008，35（6）：648.

［10］ 符古雅，李伯灵，邹志芳，等.复合枸杞多糖对接触氟化物者免疫调节和抗脂质过氧化作用［J］.职业与健康，2009，23（5）：324.