应力作用下成骨细胞的差异蛋白质组学研究

李 彬，张西正，朱 旭，高 皓

成骨细胞是骨组织修复过程中的主要功能细胞，其增殖活性和功能状态的改变直接反映了骨组织生长重建的状态。大量研究证实，应力作用下成骨细胞内蛋白质的结构和位置发生改变，从而激活细胞内的信号转导通路，影响蛋白质的活性、基因的表达，最终调控骨的生成与重建［1－4］。然而，这些已有的研究结果还是难以解释其中复杂的生理学现象。蛋白质组学的发展为研究应力、应变作用下成骨细胞功能状态的改变提供了新的方法。通过差异蛋白质组研究可以筛选并识别参与细胞生命活动过程的重要蛋白质，为深入探索其机制提供信息［5］。本研究采用蛋白质组学技术，通过比较成骨细胞在应力作用下蛋白质表达谱的变化，找出在应变作用下，发生了明显、稳定的质和量改变的差异蛋白，为骨缺损、骨折不愈合的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar 乳鼠(48 ～72 h)由军事医学科学院卫生环境医学研究所二级动物房提供。

1.1.2 主要试剂 DMEM 培养液(Gibco，美国);胎牛血清(中国医学科学院血研所科技公司);丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸(glycine)(Bio－Rad公司，美国);四甲基乙二胺(TEMED)、Triton X－100、3－［3－(胆酰胺基丙基)二甲基铵基］－1－丙磺酸盐(CHAPS)、Pharmalyte 3－10(Sigma 公司，美国);IPG 缓冲液、IPG 干胶条(pH =3－10;L =7cm)尿素(Urea)、低分子量标记物(Amersham Pharmacia 公司，美国);二硫苏糖醇(DTT)(Promega公司，美国);十二烷基磺酸钠(SDS)(Nacalai tesque公司，日本);苯甲基磺酰氟(PMSF)(Merck 公司，德国);三羟甲基氨基甲烷(Tris)(华美生物工程公司，中国);碘乙酞胺(iodoacetamide)(Fluka 公司，美国)。其余为国产分析纯试剂。

1.1.3 主要设备 Mini－PROTEAN 电泳单元及附件、ProteinⅡ垂直电泳单元及附件(Bio－Rad 公司，美国);IPGphor、附件和循环水浴(Amersham Pharmacia公司，美国);3 K18 高速低温离心机(Sigma 公司，美国);U－2001 紫外分光光度计(HITACHI 公司，日本);NAPCO CO2培养箱(Forma Scientific 公司，美国);CO2细胞培养箱(Forma Scientific 公司3111 型，美国);超净工作台(苏净公司SW－CJ－1F 型，中国);倒置显微镜及照相系统(Olympus，日本);体外牵张应力加载细胞培养体系为军事医学科学院卫生装备研究所张西正教授研制的四点弯曲细胞单向交变应变细胞加载装置。图像分析软件为Image Master.2D Elite(Version 2.00)(Amersham Pharmacia 公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 鼠成骨细胞的培养、纯化、鉴定及加载处理 采用消化传代法及细胞反复贴壁法对Wistar 大鼠乳鼠颅盖骨进行成骨细胞的提取、培养及纯化，获得的细胞置于37 ℃、体积分数为5% CO2细胞培养箱内，以10%DMEM 培养液进行培养。对第三代细胞进行钙－钴法ALP 染色，Ⅰ型胶原免疫组化染色，HE染色法鉴定细胞形态，以确认其为成骨细胞。取生长良好的第三代成骨细胞，以5×104密度接种于四点弯曲加载装置中，可弯曲的弹性长方形培养板的细胞培养小室上，待细胞大部贴壁后，根据文献［6］选择以下参数:以频率为0.5 Hz，应变水平2000 με 条件下加载6 h，设等量对照，对照组在整个培养期间不加力。

1.2.2 双向凝胶电泳 将加载6 h 后的细胞培养板取下，0.25%胰酶消化，裂解细胞后将产物于4 ℃下，14 000 r/min 离心30 min。取上清液采用考马亮蓝G250 法对蛋白溶液进行定量。将蛋白样品溶液与适量泡胀缓冲液(8.0 MUrea，2%CHAPS，2.8%DTT，0.5%IPG Buffer，痕量溴酚蓝)混匀，总体积为125 μl，其中上样量为200 μg，取IPG 胶条转移入第一向等电聚焦电泳槽。等电聚焦结束后，取出IPG胶条置于含DTT 的平衡缓冲液中平衡，将平衡好的胶条放入预先制备好的SDS－PAGE 凝胶中进行第二向垂直电泳。在14 ～15 ℃时，以每一胶条30 mA恒流电泳，直至溴酚蓝前沿至玻璃板下缘为止。凝胶行考马亮蓝R250 染色。1.2.3 图像扫描与分析 染色后的双向电泳凝胶用GS－710 光密度仪透射扫描。利用图像配比分析找出表达差异蛋白斑点，然后根据光密度值的变化来判断蛋白斑点表达量的变化，利用设置定量和统计参数来分析两者之间的差别。为了较准确地反映蛋白点量的变化，将每个点的含量表示为体积百分含量，即一个蛋白点的量占该胶内所有蛋白点总量的百分数，也称相对含量。蛋白点分子量和等电点采用二维校正法确定。所有数据的统计分析均在Microsoft Excel 2000 中进行。

2 结果

2.1 蛋白质提取率 采用考马亮蓝G250 对蛋白进行定量，用牛血清白蛋白制作标准曲线，相关系数达到了0.9989。每4 块培养板可收集细胞4 ×106左右，每实验批次收集细胞106个，加入裂解液60 μl，平均蛋白浓度为(5.58 ±0.30)μg/μl。

2.2 对照组和加载组成骨细胞蛋白质组谱图 对照组和加载组成骨细胞从培养到双向电泳各重复4 次，图1 为分辨率和重复性较好的2－DE 图谱。对照组平均检测到(512 ±11)个蛋白点，加载组平均检测到(533 ±14)个蛋白点。这些蛋白质等电点和分子量分布范围广，但大多数集中于pI(等电点)4 ～7、分子量20 ～100 ku 区域。匹配结果显示，对照组成骨细胞中平均匹配的蛋白点为413 个，加载组为411，平均匹配百分率分别是80.6%和77.2%，对照组成骨细胞的匹配率高于加载组，这与把它选做参考胶有关。

2.3 应力作用下成骨细胞蛋白质组的表达变化9 种蛋白的表达在应变作用后发生了明显的改变。其中2 种在应变作用后表达降低，7 种增高。差异蛋白的部分放大图谱如图2、3。等电点、分子量见表1。

图2 应变作用后部分差异蛋白的放大图谱(加载组表达增加的组)

图3 应变作用后差异蛋白的放大图谱(加载组表达减少的组)

表1 应变作用后9 种蛋白质变化情况

3 讨论

有关应力作用下成骨细胞蛋白质2－DE 的样品制备方法目前鲜见报道。本研究根据蛋白质样品制备应该遵循的几个基本原则［7，8］，对应力作用下鼠成骨细胞蛋白质2－DE 样品制备的各个环节和参数进行了一定的优化，初步建立了行之有效的成骨细胞蛋白质2－DE 样品的制备方法。首先，选择了含CHAPS 而非TritonX－100 的裂解液作为工作液，是因为当单独使用尿素的时候，CHAPS 的效果比TritonX－100 要好［9］。其次，笔者在提取细胞后，用PBS 清洗后马上加入裂解液，充分裂解后及时上样，使样本制备步骤尽可能简单，避免了反复冻融样本及复杂样本制备步骤会损失样本中的部分蛋白质的缺点［10］。再者，采用了考马亮蓝R250 染色，上样量选择为200 μg。一方面是因为银染法存在某些不足，如一些条带的可重复性差，动力学范围小，一些普通的蛋白染色较差甚至根本没有，并且对以后的质谱测定也有干扰，必须先脱银等;另一方面，如上样量过高，则高丰度蛋白质的斑点过大会影响其他蛋白质点的分离和分析。

蛋白质在转录时，一个基因可能以多种mRNA形式剪接，并且同一蛋白质可能以多种形式进行翻译后的修饰。一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目可以超过基因组的数目，因此蛋白质表达谱比mRNA 表达谱更能真实地反映生物体的功能及其机制。本试验中通过对比成骨细胞加载前后蛋白电泳图谱发现，两组电泳的蛋白点大多数集中于pI(等电点)4 ～7、分子量20 ～100 ku 的区域，其中至少有9 种蛋白质在应变作用后发生了明显和稳定的质和量的改变。已有文献［11、12］运用基因芯片技术分析了在应力作用下成骨细胞基因表达的差异，表明应力刺激对成骨细胞多种基因的表达产生了影响，这些变化基因的生物学功能涉及成骨、细胞增殖、蛋白质合成、信号转导、细胞骨架重建等诸多方面。而本试验中所获得的9 种差异表达蛋白质也应该牵涉其中，甚至可能是成骨细胞在应变作用下，基因表达发生变化后合成的新蛋白质。

临床各种原因所致骨缺损、骨不连的修复重建是一个重要课题，组织工程技术为这一课题带来新的亮点和希望。已有运用同种异体软骨细胞或PDILA 复合物进行即时修复软骨缺损的成功试验［13］，表明组织工程化骨有望成为一种理想的骨缺损修复材料。实现骨材料中成骨细胞的大量增殖和分化一直是骨科研究热点，目前健康人成骨细胞系的建立多采用健康成人的松质骨或4 月龄正常胎儿的四肢皮质骨进行分离、培养。但由于人体研究的特殊性，人成骨细胞系的建立不同程度受到取材及伦理的制约，目前不少学者用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，所培养的细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能，是体外实验研究的理想模型，因此本试验也采用鼠成骨细胞作为研究对象。本研究中表达发生改变的9 种差异蛋白质就可能在应力作用下对成骨细胞的增殖、分化起着重要作用。如能找出可以促进成骨及细胞增殖的特异蛋白或新的蛋白并加以提取，将其与细胞、支架材料复合，联合在体外进行三维培养，应该能为体外构建组织工程化骨，从而为解决临床上骨缺损、骨折不愈合的难题提供新的解决方法。

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