海参多肽脱色脱腥工艺的优化研究

郑金娃,汪秋宽,何云海,刘舒,任丹丹

(大连海洋大学辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室,辽宁大连116023)

海参多肽脱色脱腥工艺的优化研究

郑金娃,汪秋宽,何云海,刘舒,任丹丹

(大连海洋大学辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室,辽宁大连116023)

以仿刺参Apostichopus japonicus为原料,经复合酶解得海参多肽酶解液,通过静态吸附试验及柱层析分离试验研究了粉末活性炭、颗粒活性炭、硅藻土、强碱性阴离子树脂 (D280)、弱碱性阴离子树脂(D380)、弱酸性阳离子树脂 (D301R、D315、D301T、D152)和大孔吸附树脂 (D3520、ADS-5、ADS-7)对海参多肽酶解液的脱色脱腥效果,以优化海参多肽脱色脱腥工艺。结果表明:树脂D280的脱色脱腥效果最佳,最佳脱色脱腥工艺为酶解液与树脂体积比为3∶1,流速为2 mL/min,在此脱色脱腥工艺条件下,脱色率达69.78%,游离氨基酸态氮回收率为86.42%,海参多肽回收率为82.49%,脱腥率达67%,海参多肽酶解液通过D280脱色脱腥后,其游离氨基酸态氮含量为461.7 mg/L,海参多肽含量为9.77 mg/mL。

海参多肽;树脂;脱色;脱腥

海参是一种高蛋白、低脂肪、低糖、高营养价值的海产品,含有18种以上的氨基酸和多种维生素及丰富的微量元素,已成为传统的美味佳肴和保健品[1]。海参有生百脉血、补肾益精、壮阳疗痿、除劳祛症、滋阴利水、补正软坚和通肠润燥等多种功能[2]。现代药理研究表明:海参体壁真皮结缔组织、体腔、内腺管及内脏均含有生物活性物质,如海参毒素、海参多糖、海参皂苷、脂肪酸、多肽、海参神经节苷酯等[3-5]。海参多肽具有良好的溶解性和稳定性,易消化吸收,食用安全,具有降血压、预防心脑血管疾病、提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳和抗氧化等生物活性[6]。因此,肽制品已成为海参深度开发的重要方向。

海参本身为棕色或者深褐色,其蛋白酶酶解液的颜色为深灰色,不仅影响了产品的外观,也有碍于对产品的深度开发,因此,对海参多肽酶解液进行脱色脱腥处理具有重要意义。目前,许多学者研究了海参多肽的制备及其功能性作用,但对于海参多肽酶解液脱色脱腥的研究尚未见报道。本研究中,作者以仿刺参 Apostichopus japonicus为原料,利用具有色素吸附功能的活性炭、硅藻土以及9种树脂对海参多肽酶解液脱色脱腥工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料

半干海参购于大连商场;枯草杆菌中性蛋白酶和风味蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司;粉末活性炭、颗粒活性炭购于沈阳新兴试剂厂;硅藻土购于汕头市西陇化工有限公司;D301R、D380、D315、D280、D301T、ADS-5、ADS-7、D152、D3520 9种树脂购于天津南开和成科技有限公司;三氯乙酸、甲醛、氢氧化钠、硫酸铜均为分析纯。

UV-754型紫外可见分光光度计为上海第三分析仪器厂产品;SBS-100型数控计滴自动部分收集器为上海沪西分析仪器厂产品;BT00-100M型恒流泵为保定兰格恒流泵有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 用复合酶解法制备海参多肽的工艺流程

半干海参→脱盐→去除内壁膜,加入2倍水均质→加入枯草杆菌中性蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解→灭酶→离心得上清液备用。

1.2.2 海参多肽脱色脱腥试验

1)不同脱色剂的脱色脱腥试验。首先将一定量的海参多肽酶解液置于50 mL烧杯中,分别加入质量分数为2%的粉末活性炭、颗粒活性炭、硅藻土,充分搅拌后,调节pH至5.0,于60℃下水浴60 min,抽滤得上清液,测定吸光度,计算脱色率、氮回收率,并进行腥味值感官评定。

2)粉末活性炭的脱色脱腥正交试验。设计4因素3水平的正交试验L9(34),因素水平见表1。

表1 粉末活性炭脱色正交试验因素水平表Tab.1 Orthogonal factors and levels table for decolorization by activated carbon powder

3)树脂静态脱色脱腥试验。准确称取预处理过的 9 种 树脂 D301R、D380、D315、D280、D301T、ADS-5、ADS-7、D152、D3520各10 mL放入50 mL的锥形瓶中,加入海参多肽酶解液30 mL,在室温下振荡2 h后[7],用滤纸过滤,测定每种树脂上清液的脱色率以及脱色后氨基酸态氮的回收率和海参多肽的回收率。

4)树脂动态吸附试验。取60 mL树脂,装填入层析柱 (30 cm×1.6 cm)中,海参多肽酶解液的体积为 180 mL,用恒流泵分别以 1、2、3 mL/min的流速泵入柱内进行脱色,用自动部分收集器进行收集,每管3 mL。收集洗脱液,计算脱色率以及脱色后氨基酸态氮的回收率和海参多肽的回收率,并进行腥味值的感官评定。

1.2.3 测定方法

1)多肽含量和游离氨基酸态氮含量。用三氯乙酸 (TCA)沉淀法结合双缩脲法[8-9]测定多肽含量;用甲醛滴定法[10]测定游离氨基酸态氮含量。

2)脱色率。用722分光光度计测定脱色前与脱色后上清液的吸光度值OD0、OD1(波长为458 nm),计算脱色率[11]:

脱色率 (%)=(OD0-OD1)/OD0×100。

3)氮回收率。用722分光光度计测定酶解液及滤液的吸光度值 OD酶解液、OD滤液(波长为540 nm),计算氮回收率[12]:

氮回收率 (%)=OD酶解液/OD滤液×100。

4)海参多肽回收率。计算公式为

多肽回收率(%)=酶解液脱色后的多肽含量/酶解液脱色前的多肽含量×100。

5)腥味值的感官评定。以基本无腥味为10分;略有腥味为8分;腥味较弱为6分;腥味一般为4分;腥味略重为2分;腥味很重即未进行脱腥处理为0分。以8人小组评分,取其平均值[13],脱腥率以百分数形式表示。

2 结果与讨论

2.1 不同脱色剂对脱色脱腥效果的影响

用粉末活性炭、颗粒活性炭和硅藻土3种脱色剂对海参多肽酶解液进行脱色脱腥,得到的脱色率、氮回收率和脱腥率如图1所示。由图1可以看出,在相同的时间、温度、脱色剂用量及相同的pH条件下,粉末活性炭、颗粒活性炭和硅藻土3种脱色剂对海参多肽酶解液都有一定的脱色脱腥效果。其中,粉末活性炭脱色率最高,硅藻土的脱色率最低;粉末活性炭的脱腥效果最佳。考虑到粉末活性炭的脱色率和脱腥效果均较佳,本研究中选用粉末活性炭进一步进行正交试验优化。

图1 3种脱色剂对脱色率、氮回收率和脱腥率的影响Fig.1 Effects of decolorant on decolorization rate,re covery of nitrogen and deodorization rate

2.2 粉末活性炭脱色脱腥正交试验

用活性炭粉末作为脱色剂,以pH、粉末活性炭用量、温度和时间为因素,以脱色率和氮回收率为指标,设计4因素3水平的正交试验,正交试验结果见表 2。由表 2可以看出,脱色率最高达83.82%,氮回收率最高为49.19%。虽然用活性炭粉末脱色效果较好,但是氮回收率较低,最高也超不过50%,这样造成的损失较大,而且呈现出脱色率与氮回收率成反比的关系,即脱色率较高时氮回收率却较低,用粉末活性炭作为脱色剂对酶解液中含氮化合物吸附也较大。

2.3 静态吸附筛选树脂

9种树脂的脱色效果差异明显,其中游离氨基酸态氮浓度为556.5 mg/L时,脱色率、脱色后氨基酸态氮的回收率和海参多肽回收率以及脱腥效果最佳,如图2和图3所示。从图2可以看出,不同树脂的脱色能力差异较大,D301R、D315脱色效果较差,其他树脂的脱色效果相对较明显。其中,从树脂极性来看,大孔吸附树脂ADS-5、ADS-7、D3520的脱色率在60%以上,估计酶解液中的色素可能为非极性分子;从树脂性质来看,阴离子交换树脂如 D280、D301T、D380的脱色率也较高(50%～70%),酶解液中的色素有可能属于阴离子型。因此,树脂脱色可能与树脂极性有关,也与树脂离子有关[14]。

表2 粉末活性炭脱色脱腥的正交试验设计与结果Tab.2 Orthogonal test results for decolorization and deodorization by activated carbon powder

图2 9种树脂静态脱色脱腥试验结果Fig.2 The decolorization and deodorization by nine kinds of resins in the static adsorption experiments

氨基酸态氮回收率和海参多肽回收率同样也是重要的指标。D280、D380两种树脂在氨基酸态氮浓度为556.5 mg/L时,脱色率分别为58.91%、50.36%,多肽回收率分别为85.52%、95.37%,较其他树脂高,且其氨基酸态氮回收率分别为83.02%、72.41%,略低于非极性大孔吸附树脂D3520、ADS-5、ADS-7的氨基酸态氮回收率。同时对9种树脂的脱腥效果 (氨基酸态氮浓度为556.5 mg/L)进行了感官评价,结果见图3。由图3可以看出,9种树脂的脱腥效果都较好,其中脱腥效果最好的是D3520,D280、D380树脂也有较强的脱腥效果。综合考虑,选用D280、D380树脂作为动态试验的脱色剂,其脱色率、氨基酸态氮回收率和海参多肽回收率都较好。

图3 9种树脂的脱腥效果Fig.3 Deodorization effect of nine kinds of resins

2.4 阴离子离交吸附柱层析分离试验

以D380、D280阴离子树脂作为脱色剂,分别用3种不同的流速1、2、3 mL/min在相同试验条件下进行阴离子离交吸附柱层析分离试验,结果如图4、图5所示。从图4可以看出,除3 mL/min流速外,其他流速下D280的脱色率都比D380的要高,且游离氨基酸态氮回收率和海参多肽回收率也比D380的高。从图5可以看出,D280树脂整体脱腥效果优于 D380树脂。因此,本研究中选用D280为脱色剂。将3种流速下D280的脱色效果进行比较,结果表明,流速为2 mL/min时D280脱色剂的各项指标均较好,脱色率最高,为69.78%,游离氨基酸态氮回收率为86.42%,海参多肽回收率为82.49%。

图4 D380、D280树脂离交吸附柱层析分离试验结果Fig.4 Separation of anion-exchange column chromatography on D380 and D280

3 结论

1)采用粉末活性炭、颗粒活性炭和硅藻土3种脱色剂对海参多肽酶解液进行脱色,粉末活性炭虽然脱色率最高达83.82%,但是正交试验中的氮回收率却很低,均不超过50%。因此,综合考虑粉末活性炭不适合作为脱色脱腥剂。

图5 D380、D280阴离子树脂的脱腥效果Fig.5 Deodorization effect of D380 and D280

2)通过树脂脱色脱腥试验发现,海参多肽酶解液中的色素可能是由非极性分子或阴离子型分子所构成。最佳脱色脱腥剂为D280,其最佳脱色脱腥工艺为:酶解液与树脂体积比为3∶1,流速为2 mL/min。在此条件下,脱色率为69.78%,游离氨基酸态氮的回收率为86.42%,海参多肽的回收率为82.49%,脱腥率达67%,脱色后游离氨基酸态氮的含量为461.7 mg/L,海参多肽的含量为9.77 mg/mL。

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Technique optimization of decolorization and deodorization for sea cucumber hydrolysates

ZHENG Jin-wa,WANG Qiu-kuan,HE Yun-hai,LIU Shu,REN Dan-dan

(Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The combined enzymes were applied to hydrolyze sea cucumber Apostichopus japonicus in order to produce sea cucumber peptide hydrolysates which were then decolorized and deodorized by activated carbon powder, activated carbon granule,diatomite,and also strongly basic anion-exchange resin(D280),weakly basic anionexchange resin(D380),weekly acidic cation-exchange resin(D301R,D315,D301T,D152)and macroporousadsorption resin which were all carried through the static adsorption experiments and separation experiments of anion-exchange column chromatography(D3520,ADS-5,ADS-7).The D280 was found to be better for decolorization and deodorization.The orthogonal optimization test of the dynamic elution factors for decolorization revealed that the decolorization rate of 69.78%was detected by dynamic elution test and the deodorization rate of 67%was determined by sensory inspection at the ratio of the enzymatic hydrolysates to resin=3∶1 in volume at flow rate of 2 mL/min,with free amino acid nitrogen recovery of 86.42%and polypeptide recovery of 82.49%.There was free amino acid nitrogen content of 461.7 mg/L and peptide content of 9.77 mg/mL in the hydrolysates in the sea cucumber decolorized and deodorized by D280.

peptide in sea cucumber;resin;decolorization;deodorization

TS254.4

A

2012-10-20

国家科技成果转化项目 (2008GB2B000061)

郑金娃 (1987-),女,硕士研究生。E-mail:418994603@qq.com

汪秋宽 (1962-),女,教授。E-mail:wqk320@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)03-0303-04