高效液相色谱-质谱法测定配合饲料中氯霉素残留量的研究

2013-07-09魏云计

饲料博览 2013年4期

魏云计，冯民

（淮安出入境检验检疫局，江苏淮安 223001）

因对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有很强的活性，氯霉素表现出广谱的抗菌能力，广泛地应用于动物养殖业。由于其能导致人体产生再生障碍性贫血和溶血性贫血等毒副作用，欧盟、美国等先后将其定为禁用药物，不得用于畜牧养殖业中，虽然其在动物体内残留量低，但毒副作用依然存在[1]。饲料一般是兽药添加的主要载体，开展饲料中氯霉素检测是从源头进行兽药残留控制的有效方法，因此研究配合饲料中氯霉素检测方法具有重要意义。

目前国内外关于组织中氯霉素的残留检测方法已很成熟，主要采用酶联免疫法、高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法等[2-18]。由于饲料的品种较多，组成复杂，使用普通的检测仪器测定其药物残留基质干扰较大，本研究利用液相色谱-质谱法的强选择性和抗干扰能力特点，建立了饲料中氯霉素残留的快速定性定量方法，定量限为0.3 μg·kg-1远远低于GB/T 21108-2007 规定的限量，对配合饲料生产和畜牧养殖具有指导意义。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Finngan TSQ Quantum Ultra ENR 串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）；C18 柱（150mm×3.1 mm i.d.,3.5 μm,Agilent）。

甲醇为色谱纯，乙酸乙酯、正己烷、氯化钠均为分析纯，水为去离子水。氯霉素标准品均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，纯度≥98%，氘代氯霉素（chloramphenicol-D5）购自WITEGA Laboratorien Beelin-Adlershof GmbH公司，用甲醇溶解并配制成1.0 mg·mL-1标准储备液，再根据需要稀释成适当浓度的混合标准工作液，4℃避光保存。

1.2 样品前处理

准确称取饲料2.00±0.05 g于50 mL 具塞离心管中，加入水4 mL，于涡旋混合器上混匀30 s 后静置10 min待饲料浸润，加入氨化乙酸乙酯（乙酸乙酯/25%氨水，v/v，98∶2）10 mL，于涡旋混合器上快速混匀30 s，超声波提取10 min；8000 rpm离心3 min，取上层有机溶液至50 mL梨形瓶中；向残渣中加入氨化乙酸乙酯8 mL，进行二次提取，方法同上，合并两次上层清液于45℃水浴中减压浓缩至干，用甲醇/水（v/v，2∶8）1 mL 溶解残留物，加入正己烷1 mL 净化脱脂，离心后取下层，经0.45 μm滤膜过滤，滤液供液相色谱-质谱仪测定。

1.3 液质联用仪分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm i.d.,3.5 μm）；进样量为25 μL；柱温为30℃；流动相为A去离子水、B甲醇；梯度洗脱条件为0～4 min A 70%；4.1～6.5 min A 20%；6.6～8.5 min A 70%；流速为250 μL·min-1。

1.3.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，喷雾电压2500V，多反应监测（MRM）方式检测，优化质谱条件见附表。

附表氯霉素优化的质谱条件

1.4 线性范围、检出限和定量限

配制6个不同质量浓度的标准溶液，溶液中氯霉素为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng · mL-1，氘代氯霉素-D5 的质量浓度为5.0 ng·mL-1，测定峰面积，以质量浓度为横坐标，峰面积的比值（氯霉素峰面积/氘代氯霉素-D5 面积）为纵坐标，绘制标准曲线。在空白配合饲料基质中添加氯霉素标准品，以信噪比（S/N）≥3时的含量定为方法的检出限（LOD）；以信噪比（S/N）≥10 时的含量定为方法的定量限（LOQ）。

1.5 回收率的测定

选取阴性配合饲料样品，添加氯霉素标准品和内标，氯霉素标准品添加水平为0.3、1.0、5.0 μg·kg-1，氘代氯霉素-D55.0 μg·kg-1，每个添加水平5次平行。

2 试验结果

对30个配合饲料样品进行检测，发现有12个样品氯霉素残留量＞0.3 μg·kg-1，其药物残留量均低于国家残留监控的限量要求，按照本方法的定量限计算阳性率为40.0%。

2.1 线性范围、检出限和定量限

饲料中添加氯霉素0.3 μg·kg-1、氘代氯霉素-D55.0 ng·mL-1标准品MRM色谱图见图1，标准溶液的MRM 色谱图见图2。结果表明，氢霉素的回归方程为Y=0.0426245+0.0142396X，相关系数为0.9939，检出限为1，定量限为0.3。

图1 饲料中添加氯霉素0.3 μg·kg-1、氘代氯霉素-D55.0 ng·mL-1标准品MRM色谱图

图2 氯霉素、氘代氯霉素-D5标准溶液MRM色谱图

2.2 回收率和精密度

结果表明，回收率平均在89.7%～105.6%，相对标准偏差（RSD）低于8.7%。

3 讨论

3.1 提取条件的优化

氯霉素属于弱极性物质，易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，可以通过这些溶剂提取。乙酸乙酯对氯霉素的提取效率最高，适合于动物组织样品的提取。由于配合饲料含有大量的脂肪、蛋白质、纤维素、矿物质等复合组分，本研究比较了上述几种溶剂及碱化乙酸乙酯提取效率，结果表明，碱化乙酸乙酯提取效率优于其他几种常见试剂，试验对碱化乙酸乙酯的浓度进行优化，结果表明，当乙酸乙酯/25%氨水（v/v，98∶2）时提取效率及稳定性最好，随着氨水比例提高，提取效率没有提高，反而对提取的基质干扰越大；同时饲料样品的水分很少，在提取前充分润湿有利于目标物的提取，提高回收率。

3.2 样品的净化

碱化乙酸乙酯提取效率虽高，但提取的非极性脂溶物较多，基质干扰较大，需要进一步净化。GB/T 21108-2007和文献报道的净化方法用甲醇和氯化钠4%溶液溶解目标物，正己烷净化脱脂两次，乙酸乙酯进行液-液分配萃取净化，再过SPE 固相萃取柱净化。本研究结果表明，在甲醇/水（v/v 2∶8）1 mL溶解残留物后用正己烷1 mL净化脱脂，可以有效的去除基质干扰，省去固相萃取过程，缩短样品前处理时间。

4 结论

本试验建立了配合饲料中氯霉素测定的高效液相色谱-质谱法。串联质谱和同位素内标的使用消除了配合饲料复杂基质的影响，提高定量的准确性。该方法操作简便，省去固相萃取步骤，缩短检测周期，灵敏度较高，回收率较好。

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