基于能量转移的荧光纳米传感器研究进展

田力，韩鑫，张纪梅

（天津工业大学环境与化学工程学院，天津300387）

基于能量转移的荧光纳米传感器研究进展

田力，韩鑫，张纪梅

（天津工业大学环境与化学工程学院，天津300387）

从核酸分析、细胞成像、环境监测和生物识别等多个方面综述了荧光共振能量转移（FRET）、纳米材料表面能量转移（NSET）、化学荧光共振能量转移（CRET）等荧光纳米传感器中3种常见光谱技术的最新研究进展，并对荧光纳米传感器在生物标志物发现、疾病早期检测与诊断、生物成像和体内药物输送等生物、化学领域中的发展前景进行了展望.

荧光纳米传感器；荧光共振能量转移；纳米材料表面能量转移；化学荧光共振能量转移

荧光纳米传感器在生物检测、环境监测、细胞成像、疾病诊断与治疗等方面的应用引起了人们的广泛关注[1-2].荧光共振能量转移（FRET）、纳米材料表面能量转移（NSET）和化学荧光共振能量转移（CRET）是荧光纳米传感器中3种最常用的光谱技术，它们都涉及供体与受体之间的非辐射能量转移.能量转移机制提供了一种新颖的构建生物、化学传感器的方法，其独特的空间效应与光谱效应赋予了传感器突出的性能.比如，能量转移可用于设计荧光比率探针，与单信号荧光探针相比，比率探针有效地避免了探针浓度、探针环境和激发强度的干扰，极大地提高了检测的灵敏度和准确性.而且，能量转移体系中供受体之间严格的空间距离，为探索生物分子的构象变化及相互作用机制提供了理想的纳米尺.此外，在基于能量转移的传感器中，许多窄带激发的受体（比如有机荧光染料）本身又作为特异性探针部件，通过激发与受体相匹配的宽激发供体（比如量子点），间接地拓展了受体的激发范围，便于设计兼具宽带激发和高特异性的探针.本文根据能量转移途径的不同将荧光纳米传感器分为3种：基于荧光共振能量转移的纳米传感器、基于纳米材料表面共振能量转移的纳米传感器和基于化学荧光共振能量转移的纳米传感器.在此基础上介绍了其工作机理，并介绍了3种荧光纳米传感器在核酸分析、细胞成像、环境监测和生物识别等领域的最新研究进展.

1 基于FRET的纳米传感器

1.1 FRET的机理

FRET首先由Förster于1948年提出，其机理如图1所示.

图1 FRET机理示意图Fig.1 Schematic illustration of principle FRET

FRET是指当激发态的供体发射光谱与受体吸收光谱重叠，并且两个基团空间距离（R）在10 nm以内时，发生的非放射性能量转移现象[2].影响FRET能量转移效率的因素有许多种，如供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度、供体与受体之间偶极的相对取向和空间距离等.FRET对这些因素的敏感性促使其被广泛用于生物与化学检测器的构建，并在DNA识别、环境监测和生物成像等方面发挥了巨大的作用.

1.2 在DNA分子检测中的应用

寡聚核苷酸DNA序列的快速准确检测对病理学、遗传学和环境离子检测等具有十分重要的理论和现实意义.传统用于DNA检测的技术包括PCR、Northern印迹、Southern印迹等.近年来，许多课题组通过分子信标（包括量子点、有机荧光染料和金纳米粒子等）与DNA连接的方法，构建了丰富多彩的基于FRET的检测系统.

2007年美国海军生物分子研究实验室Medintz等[3]将“发卡”型探针用于DNA检测.这是一种荧光“关闭型”检测系统，两端分别连接荧光染料和量子点的DNA，通过局部自我互补配对形成“发卡”结构.探针与互补DNA序列的杂交打开了“发卡”结构，使量子点与荧光染料基团远离，导致FRET过程中断和量子点荧光恢复.这种方法可以检测nM级别的DNA.

2009年加拿大多伦多大学Krull等[4]报道了一种“三明治FRET”，分别连接有量子点和有机荧光染料的两条DNA被用于目标DNA的比率检测.这种方法不仅避免了对目标DNA进行标记，而且也能够实现低至1 nM DNA的灵敏检测.

此外，2006年新西兰奥克兰大学Peng等[5]设计了一种静电作用介导的基于FRET的DNA探针，与通过共价方式连接的探针不同,此探针主要通过能量转移效率的变化实现目标DNA的检测.

1.3 在离子检测中的应用

许多金属离子如Hg2+和Pb2+等，即使浓度很低，也能够对人类健康和环境造成严重危害.因此，探究有效检测重金属离子的方法成为人们研究的热点.

2008年厦门大学Shang等[6]成功地将基于罗丹明B开环效应的FRET方法用于Hg2+检测.2012年华南理工大学Liu等[7]将供体量子点和受体罗丹明B探针分别固定在二氧化硅球的中间和表层，构建了基于FRET的汞离子探针.由于罗丹明能与Hg2+特异性络合，因而探针具有较好的选择性.

2009年厦门大学Guo等[8]将量子点作为能量供体，金纳米粒子作为能量受体，通过静电作用，构建了基于FRET的Pb2+探针.2010年华南理工大学Ma等[9]报道了一种检测水溶液中Fe3+的方法，该FRET比率检测系统的最大优点在于能使水溶性差的罗丹明探针实现水溶性检测.2011年山东师范大学Xue等[10]设计了一种基于氢键对FRET效率调节效应的F-探针.基于FRET用于检测Cu2+、Zn2+等离子的探针也数不胜数[11-12]，为疾病预防和环境监测做出了巨大贡献.

1.4 在pH值检测中的应用

pH值对细胞功能有重要的影响.大多数细胞过程，包括细胞体积变化、囊泡运输、细胞的新陈代谢和信号传导等都需要通过pH值来调节.细胞内pH值可以通过多种方式进行测量，比如核磁共振、吸收光谱和荧光光谱等.特别地，基于FRET的荧光光谱技术由于具有高灵敏度和出色的时空分辨率，在衡量细胞内pH值方面得到了广泛的应用.

2012年德国埃默里大学Bao等[13]开发了一种pH探针，相比传统由荧光染料构建的pH探针，这种探针具有很高的灵敏度和光稳定性，而且能够检测较宽范围内的pH值（6.2～8.3）.2013年韩国忠南国立大学Seo等[14]首次将由聚二乙炔囊泡构建的FRET探针用于pH检测.2013年印度特里普拉邦大学Hussain课题组[15]设计的探针能够对3～12范围内的pH值进行检测，极大地拓展了FRET探针在广谱pH测试中的应用.

1.5 在有机化合物检测中的应用

2008年中国科学院Gao等[16]开发了一种检测TNT的传感器，将荧光染料和有机胺化合物通过共价键连接到二氧化硅纳米粒子的表面，TNT可以通过FRET作用使荧光染料淬灭.该传感器能够灵敏地检测溶液中低至1 nM的TNT，同时还具有荧光稳定和亲和力强等优点.

2012年安徽师范大学Zhang等[17]为检测溶液中的三聚氰胺，将带负电的金纳米粒子通过静电作用吸附在掺杂量子点的二氧化硅纳米微球表面，构成了一个FRET体系.当体系中存在三聚氰胺时，三聚氰胺中的氨基与金纳米粒子共价结合，从而降低了量子点与金纳米粒子之间的FRET效率，导致量子点荧光增强.相比量子点与金纳米粒子组成的FRET传感器（检测限5.3 nM），这种体系的检测限（0.9 nM）几乎提高了50倍.

1.6 在蛋白质检测中的应用

蛋白质的灵敏检测在疾病早期诊断、治疗以及药物筛选等应用中至关重要[18].基于FRET的荧光传感器已经成功地用于蛋白质检测.2010年美国海军实验室生物分子研究中心Prasuhn等[19]利用修饰荧光染料的量子点，合成了基于FRET的能够监测酶活性的传感器，展示了其监测生物过程的巨大潜力.2012年华南理工大学Liu等[20]以量子点为能量受体，有机荧光染料为供体，构建了检测人类甲胎蛋白的FRET传感器，为癌症的发现提供了一种有效的工具.

1.7 在生物成像中的应用

荧光成像是实时的、无创监测的、具备高时空分辨率的生物分子技术之一.荧光探针是非常重要的生物成像工具.基于FRET的荧光探针，由于不受探针浓度、探针环境和激发强度的干扰，在生物细胞和医学诊断成像中发挥了巨大的作用[21]。美国加州大学Albers和Takakusa等[22-23]较为全面地综述了FRET荧光探针在生物成像中的应用.2011年湖南大学Yuan等[24]构建了一种FRET荧光成像平台，它主要由罗丹明B、氟硼荧和哌啶基组成.哌啶基连接的罗丹明B和氟硼荧能够与细胞中的半胱氨酸相互作用，产生FRET效应，导致罗丹明B的荧光淬灭和氟硼荧的荧光增强，从而实现细胞成像.

2 基于NSET的纳米传感器

FRET是当前最活跃的研究领域之一，但是FRET存在着许多严重缺陷，比如供受体之间的空间距离较短和偶极-偶极空间相对取向的限制等.为了克服这些缺陷，人们提出了另外一种类似FRET的机制，即NSET.

2.1 NSET的机理

NSET是供体偶极电磁场与金属导带离域电子之间相互作用的过程.与FRET相比，NSET的独特之处在于：①NSET有更大的有效作用距离，其能量转移效率与距离的关系从FRET的1/R6变成1/R4（R为空间距离）[25]，使得NSET可以作为一种长距离测量的光谱尺；②NSET不需要供受体之间发生共振电子转移；③NSET的能量受体是纳米粒子表面，在几何学上是各向同性的偶极向量分布，因而在NSET中相同的能量受体能同时淬灭不同发射的荧光供体，方便了在一个体系中同步进行多元淬灭分析.

2.2 在金属离子检测中的应用

2007年杰克逊州立大学Darbha等[26]报道了一种小型化的基于NSET的探针，能够快速、灵敏地检测土壤、水和鱼等样品中低至2 nM的Hg2+，在环境监测和食品安全中具有重大意义.2011年西弗吉尼亚大学Li等[27]构建了基于量子点-DNA-金纳米粒子的Hg2+探针.由于Hg2+能够与DNA碱基中的胸腺嘧啶（T）进行特异性结合，形成T-Hg-T配对，因此当溶液中存在Hg2+时，量子点和金纳米粒子通过DNA杂交相互接近，从而发生能量转移，引起量子点荧光强烈的淬灭.这种传感器可以检测河水中低至2 nM的Hg2+.2012年厦门大学Liu等[28]构建了一种基于NSET的Hg2+传感器，这种传感器也具有较低的检测限（2.3 nM）.

2.3 在有机化合物检测中的应用

2012年Pandya等[29]首次利用纳米姜黄色素构建痕量TNT检测的NSET传感器.在这个传感器中，缺电子TNT和富含π电子对的纳米姜黄色素可以通过静电作用形成NSET复合体，从而加速了它们之间的能量转移，导致纳米姜黄色素的荧光显著增强；并且，检测体系中的TNT含量越高，NSET复合体的荧光强度越强，提供了一种灵敏检测环境中TNT的方法，丰富了有效检测爆炸物的手段.

2013年美国加州大学Kikkeri等[30]报道了一种单步分析血清中唾液酸聚糖不同成分的荧光探针，结果表明，探针能够检测低至微摩尔范围内的唾液酸聚糖，更重要的是它能够对生物医学样品中唾液酸聚糖的不同组分进行高通量的分析与定量.

2.4 在阐释分子构象变化中的应用

NSET是一种有效研究分子构象变化的光谱尺，它的应用有助于在宏观上详细地阐释许多复杂生物分子的构象动力学.2006年美国佛罗里达州立大学Jennings等[31]发现NSET可以用于追踪RNA核酶的构象变化，在该实验中，RNA构象的4种独立状态可以从实时荧光信号上进行分辨.2008年印度科学培养协会Sen等[32]通过NSET将金纳米粒子用于蛋白质的构象变化研究，结果显示金纳米粒子淬灭色氨酸荧光主要是通过静态淬灭过程实现的.

2.5 在医学诊断中的应用

NSET在医学诊断中的应用主要是通过检测生物标志物和病毒等物质实现的.生物标志物是生理或疾病进程中某一阶段的“分子特征”.灵敏、准确地检测生物标志物，有助于疾病诊断、疾病进展的监控以及治疗效果的评估[33].2008年美国杰克逊州立大学Ray等[34]提出了一种基于NSET通过RNA选择性检测丙型肝炎病毒的方法.NSET也被用于构建B型肝炎病毒探针[35].2013年厦门大学Liu等[36]展示了一种基于荧光染料（RBITC）和金纳米粒子（AuNPS）的前列腺抗原探针，该探针具有许多优异性能如较高的灵敏性（检测限为0.032 pg/mL）、高生物亲和性及稳定性等.

3 基于CRET的纳米传感器

FRET和NSET在生物、环境和化学等领域中具有广阔的发展空间和应用前景.然而，任何荧光技术都有其自身难以避免的缺陷，比如染料的荧光漂白、易受生物系统自体荧光的干扰、供受体需要外部同步激发等[37].这些缺陷严重地限制了FRET和NSET的应用范围.在这种背景下，CRET由于无需外部激发，引起了人们越来越多的关注.

3.1 CRET的机理

CRET是荧光供体通过偶极与偶极之间的相互作用将能量传递至受体的过程[38].与FRET和NSET相比，CRET也是一种发生在短距离内的非辐射能量转移过程，供受体之间的空间距离和波谱重叠程度对CRET的能量转移效率有着显著的影响.但是CRET的荧光来自底物的光化学反应，这极大地降低了对外部激发的依赖.

3.2 在生物分子（DNA、ATP和蛋白质）检测中的应用

CRET检测平台在生物样品分析中的应用具有广阔的前景.2009年青岛科技大学Zhang等[39]报道了一种基于CRET和DNA分子信标的ATP三磷酸腺苷探针，展示了其较好的选择性和较低的检测限（110 nM）. 2011年以色列耶路撒冷希伯来大学Willner等[40]构建基于量子点、荧光胺和G-四链体DNA（富含鸟嘌呤G的DNA）的CRET传感器，并在DNA和ATP检测方面发挥了重要的作用.当向检测体系加入血红素和特异性适体底物（如DNA）时，连接在量子点表面的DNA能够折叠成量子点-血红素-G四链体复合结构.这种复合结构能够在荧光胺和双氧水缓冲溶液中产生CRET作用，导致荧光胺荧光降低和量子点荧光增强，从而实现对DNA的比率检测.更值得关注的是，通过改变G四链体DNA序列，同样的方法便可以用于检测ATP.

基于CRET的荧光探针也被用于蛋白质检测. 2011年同济大学Huang等[41]以金纳米粒子作为能量受体，开发了基于CRET的α-甲胎蛋白探针，实现了对血清中低至2.5 ng/mL的α-甲胎蛋白的灵敏检测. 2012年青岛科技大学Bi等[42]也报道了一种基于氧化石墨烯的CRET传感器，这种传感器能通过CRET高选择性和灵敏地检测DNA（H1V1）和蛋白质（凝血酶）.

3.3 在金属离子检测中的应用

2011年以色列耶路撒冷希伯来大学Freeman等[43]展示了一种基于化学发光的Hg2+探针，该探针主要包括量子点和核酸DNA.其中，DNA分别由富含鸟嘌呤（G）的辣根过氧化物酶亚基（I和II）和用于Hg2+识别的胸腺嘧啶（T）位点（III和IV）构成.探针体系中没有Hg2+时，尽管III和IV亚基含有部分互补序列，I和II亚基也不能组装成稳定的G-四链体结构.随着Hg2+的加入，III和IV部分亚基可以形成T-Hg-T配对，从而使I和II之间形成的血红素/G-四链体结构更加稳定.这种稳定的结构能够促进H2O2和荧光胺的氧化，产生化学荧光，最终通过CRET作用使连接在DNA上的量子点荧光增强.相比上文提到的基于NSET的Hg2+探针[27]，这种探针的检测限也是nM级别，但是它无需外部能量激发，因而使检测过程更加快速.

2012年广西师范大学Qin等[44]描述了一种检测Ag+的方法，该法基于化学发光与荧光三元复合物（荧光素、菲罗啉和银离子）之间形成的化学荧光共振能量转移，可以灵敏地检测水中50 nM的Ag+.

3.4 在免疫分析中的应用

CRET已被广泛的用于免疫分析.2011年广西师范大学Zhao等[45]将CRET引入免疫反应中，提高了微流体免疫检测的灵敏度.2012年Zhao等[46]设计了一种基于CRET的传感器，用于人类免疫球蛋白G（IgG）分析.用标记三羊抗体免疫球蛋白G的辣根过氧化物酶修饰磁性纳米微球，然后将磁性纳米微球与标记IgG的异硫氰酸荧光素（FITC）孵育，从而获得FITC-抗原-抗体-磁性纳米微球免疫复合物.当向体系中加入化学荧光缓冲溶液（包含荧光胺和双氧水），能量就会立刻从荧光胺传递至磁性纳米微球表面的FITC，由于CRET作用，FITC 525 nm处的荧光显著增强.这种方法可以超灵敏检测血清中2.9×10-11M的IgG.

基于石墨烯纳米片和化学发光供体的CRET方法也被用于C反应蛋白（CRP）的均相免疫分析[47].当传感器中存在CRP时，修饰特异性抗体的石墨烯纳米片可以通过CRP与标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体相连，从而构成了一个紧密的三元复合体.复合体中的HRP能够催化石墨烯周边的荧光胺产生荧光，并通过CRET作用使石墨烯的荧光增强.这种方法为其他抗原-抗体免疫蛋白的检测提供了新的思路.

4 结束语

基于能量转移（FRET、NSET和CRET）的荧光纳米传感器设计及其在基础理论和实际中的应用是近年来生物化学研究的热点.目前，这些传感器已经为高灵敏、快速、低成本的生物检测、环境监测、疾病诊断、细胞成像、化合物分析和分子相互作用机制研究等提供了强大的工具.然而，它们在实际中的应用仍然处于萌芽时期，并且由于受到许多因素的影响，如外源物质的细胞毒性、生物的自体荧光、染料的荧光漂白、外源性酶的干扰以及复杂的生物环境等，使得用于生物体的高灵敏性和特异性的荧光纳米传感器的开发面临严峻的挑战.因此，还需要对能量转移机制进行深入的探究.相信在不久的将来，这些传感器将在生物标志物发现、疾病早期检测与诊断、生物成像和体内药物输送等生物、化学领域作出更大的贡献.

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Recent advances in fluorescent nanosensors based on energy transfer

TIAN Li，HAN Xin，ZHANG Ji-mei
（School of Environment and Chemical Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

The latest researches of three common spectroscopic techniques in fluorescent nanosensor which include fluorescence resonance energy transfer（FRET），nanomaterials surface energy transfer（NSET）and chemical fluorescence resonance energy transfer（CRET）are reviewed from the arpects of nucleic acid analysis，cell imaging，environmental monitoring，researches of biometric processes and so on.Finally，a tentative outlook on future developments of biomarker discovery，disease detection and diagnosis，biological imaging，drug delivery in biological and chemical field is given.

fluorescent nanosensor；FRET；NSET；CRET

TB383

A

1671-024X（2013）06-0049-06

2013-07-11

国家自然科学基金资助项目（21106101）；天津市自然科学基金资助项目（12JCZDJC29500，13JCQNJC06300）

田力（1988—），男，硕士研究生

张纪梅（1958—），女，博士，教授，硕士生导师.E-mail：zhangjimei6d311@163.com