孕前诊断剂量超声辐照对仔鼠学习记忆能力的影响

王春燕 吉春冬

（1 四川省攀枝花市攀钢总医院功能科，四川 攀枝花617000；2 四川省攀枝花市攀钢总医院泌尿外科；四川 攀枝花617000）

孕前诊断剂量超声辐照对仔鼠学习记忆能力的影响

王春燕1吉春冬2

（1 四川省攀枝花市攀钢总医院功能科，四川 攀枝花617000；2 四川省攀枝花市攀钢总医院泌尿外科；四川 攀枝花617000）

目的探讨孕前诊断剂量超声辐照对子代生长发育及学习记忆能力是否有影响。方法对孕前1周Wistar大鼠分别给予每日10min，20min，30min诊断剂量（3.5MHz，65Mw/cm²MI=1.6，Tis=1.8）的超声辐照，并给予对照组假辐照。一周后雌雄大鼠合笼使之自然受孕及分娩，待仔鼠出生后观察其发育情况（如出生体质量、睁眼时间、皮毛发育情况等）及出生病死率，并于出生后第90d进行Morris水迷宫测试，评价其学习记忆能力。结果照射组与对照组仔鼠发育状态及出生病死率无明显差异（P＞0.05）。30min组仔鼠在水迷宫测试中内环得分（0.1201±0.0799）与对照组得分（0.2135±0.0831）之间的差异具有显著性（P＜0.05）。20min以下照射组与对照组的内环得分无显著性差异（P＞0.05）。结论给予孕前雌鼠诊断剂量的超声辐照30min对仔鼠的学习记忆能力可产生影响。

超声辐射；Morris水迷宫；学习记忆；大鼠

随着现代社会的工业化发展和人类生活方式的巨大改变，不孕患者的比率在全世界范围内越来越高。超声检查作为一种便捷、无创、可重复手段成为生殖医学实践中不可缺少的工具，尤其在孕卵监测中起到关键性作用。在此背景下，超声辐射的安全性问题得到世界范围内的广泛关注。国内外学者已对早孕期胎儿进行不同剂量超声辐照所致组织、细胞损害进行大量研究，但目前针对孕前超声辐照对孕卵影响的研究甚少。Morris水迷宫是公认的能够真实、客观地测定动物学习记忆能力的实验装置。本研究就是对大鼠孕前卵细胞进行不同剂量超声辐照，并利用Morris水迷宫来观察仔鼠学习记忆能力的变化，从而为超声在生殖医学领域中的安全应用提供具有临床价值的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物的分组

健康性成熟WISTAR大鼠60只（由济南军区总医院实验动物中心提供），其中雄性20只，雌性40只。按完全随机的方法将40只雌鼠分为对照组及照射组。照射组按照射时间分为：10min组、20min组、30min组。

1.2 动物模型的制备

雌鼠在孕前一周，选取1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉方法，剂量为30mg/kg，麻醉满意后，将雌鼠缚于实验台上，下腹部涂耦合剂，超声探头在雌鼠下腹部按既定的时间进行滑行扫查，对照组进行假辐照，其余条件相同，每日一次，连续辐照7d后将雌雄按2ı1比例合笼，使之自然受孕及分娩。

1.3 超声辐照条件

仪器：GE 730型彩色超声诊断仪；辐照条件：4V1探头，频率3.5MHz；机械指数 MI =1.6，热指数 Tis＝1.8；ISPTP：1mW/cm2；ISATA：240 mW/ cm2。40只雌鼠共产下仔鼠327只，仔鼠出生后观察其发育情况（出生体质量、睁眼时间、皮毛发育情况等）及出生病死率。

1.4 Morris水迷宫实验

随机选取各组仔鼠10只，在成熟期（生后90d）进行测试。根据动物在每一区内花费的时间，与规定的加权值相乘，结果相加来计算学习记忆成绩。Morris水迷宫是一高50cm、直径160cm的圆形水池，水池内壁为黑色，池内水深23cm，水温在（22±2）℃，实验室温度24～25℃，房间内光照恒定，水池内无光线直射。池壁上以四个等距离的点将水池分为四个象限，第一象限设为目标象限，在距离池壁35cm处放有一个高21cm、直径为12cm、的圆形黑色站台，Morris水迷宫中加入墨汁混匀，水中不能明显见到安全平台。水池四周存在丰富的空间参考线索（门、窗、灯、实验者等），应保持不变以供大鼠定位平台。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，同步记录仔鼠运动轨迹。本实验我们选取内环得分作为学习、记忆能力的评价指标。

1.5 内环得分

用SPSS17.0软件，实验所获的数据采用（χ—±s）表示，主要统计分析采用t检验。

2 结 果

见表1。

表1 辐照组与对照组的内环得分

孕前给予超声辐照30 min组的雌鼠所产仔鼠出生后90d在Morris水迷宫测试中内环得分与对照组的差异具有显著性意义（P＜0.05）。孕前给予超声辐照10min组及20 min组的雌鼠所产仔鼠在Morris水迷宫测试中所得分数均与对照组无明显差异（P＞0.05）。

3 讨 论

超声检查作为一种便捷、无创、可重复手段成为生殖医学实践中不可缺少的工具，尤其在孕卵监测中起到关键性作用。在此背景下，超声辐射的安全性问题得到世界范围内的广泛关注。国内学者已对早孕期及晚孕期胎儿不同剂量超声辐照所致组织、细胞损害进行大量研究，目前针对孕前超声辐照对孕卵影响的研究甚少。超声辐照孕卵是否会导致子代脑功能的损害还是一个全新的研究领域。目前有研究已经证实孕期给予超声辐照可引起胎儿脑组织细胞的凋亡。段云友等[1]研究发现给予诊断剂量的超声辐照可引起胎鼠小脑外颗粒层细胞的凋亡；程颜苓等[2]采用诊断剂量超声辐照孕18d的胎鼠，证实超声辐照射超过20min即可诱导胎鼠脑皮层组织神经细胞凋亡。另有研究证实超声辐照大鼠生殖系统对精细胞及卵巢细胞有损伤作用，其影响程度与辐照时间长短有关。如张希平等[3]通过动物实验发现诊断剂量超声照射可引起小鼠睾丸和精细胞的形态学及超微结构变化，并发现辐照时间相同而辐照次数不同的精子畸变率无明显差异，提示超声辐照对生精细胞损伤的程度主要取决于辐照时间，与辐照的频率关系不大，与刘望彭等[4]的研究结论相一致。曹敏丽等[5]通过照射大鼠卵巢相应部位10min，偶见c-fos的表达，随照射时间延长阳性表达呈上升趋势，至60min时阳性表达最高；持续照射30min可致c-fos-mRNA阳性表达升高，即超声持续辐照大鼠卵巢达到一定时间后可导致卵巢细胞的免疫组织发生化学反应，并通过c-fos和c-fos-mRNA系统途径诱导卵巢细胞的凋亡。目前对于超声辐照引起的子代脑功能损害的研究相对匮乏，Kieler等的研究发现胎儿时期接受超声检查会导致左利手的概率增加。周宁等对孕18d的SD大鼠给予诊断剂量（3.0MHz，MI=1.6，Tis=1.8）的超声辐照，30min组仔鼠在水迷宫测试中内环得分与对照组之间的差异具有显著性（P＜0.05），对孕鼠给予诊断剂量的超声辐照30 min可导致仔鼠的学习记忆能力下降。本实验采取Morris水迷宫对仔鼠的学习、记忆能力进行测定。在动物学习、记忆实验研究上，仪器和方法是重要的，Morris水迷宫是经典的研究动物学习、记忆的仪器，其优点：用摄像系统代替了肉眼观察，可避免人为因素的影响，更为真实、客观；依靠计算机系统和程序，不仅能测定各种实验数据，还能自动显示动物游泳轨迹。本实验采用内环得分作为评价指标。在实验中，照射30min组动物游迷宫形式呈周边型。而对照组及照射10min组、20min组动物经过3～5d的加强训练，大部分能够快速、准确找到平台位置。本实验结果显示，在孕前给予超过30min的诊断剂量超声辐照的雌鼠其子代的学习记忆能力下降。原因主要考虑为卵细胞对超声辐照敏感，超声的热效应、机械效应及空化效应等导致卵细胞发育异常。在生长发育敏感期的胎儿，即使少量细胞的损伤也可能引起严重的后果。凋亡是依赖能量的细胞内死亡程序活化而致的细胞自我清除，凋亡过多则导致过多的细胞死亡，影响脏器甚至机体的功能导致疾病。神经系统的发育是在神经细胞的增殖与自然凋亡的动态平衡中进行的。超声的生物学效应会成为影响脑细胞凋亡的因素。陈文雪等在研究诊断剂量超声对大鼠卵巢细胞凋亡的影响时发现，超声辐照可诱发卵巢组织细胞凋亡，而且处于不同发育时期的卵泡内细胞敏感度不同，不仅发生在原始卵泡、生长卵泡，在间质细胞及卵泡膜细胞也可发现明显的凋亡现象。给予诊断剂量超声辐照30min，12h后其细胞凋亡率增加，24h达到高峰，48h凋亡率开始下降，96h细胞凋亡率继续下降，120h恢复至对照组水平。诊断剂量的超声辐照大鼠卵巢组织后细胞凋亡率随时间变化的曲线呈近似抛物线状。由此证明诊断剂量超声辐照大鼠卵巢可诱导细胞凋亡增加，这种损害存在一定的可复性，且细胞凋亡率与超声输出功率呈正相关。如果发育期的卵细胞接受超声辐照不但引起卵细胞凋亡增加，间质细胞和卵泡膜细胞的凋亡增多也会引起卵细胞发育异常，打破胎鼠脑组织发育的动态平衡，可能表现为其出生后的学习、记忆能力的下降。因此在临床常规超声检查时应尽量避免长时间的辐照。

[1] Oh H,Lee SE,Yang JA,et al.Establishment of a biological indicatorfor the radiation and safety of diagnostic ultrasound using apoptosis[J].In Vivo,2000,14(4):345-349.

[2] 程颜苓,段云友,曹铁生.诊断剂量超声与胎鼠中枢神经元的凋亡[J].中华超声影像学杂志,2001,10(9):624-626.

[3] 张希平,曹晓哲,张绍增,等.诊断超声对小鼠精细胞影响的研究[J].中华超声影像学杂志,1998,7(4):245.

[4] 刘望彭,梁光荣,刘晋敏,等.不同孕期不同条件超声辐照对胎鼠生长发育的影响[J].中国超声医学杂志,1996,12(5):9.

R711.6；R-332

B

1671-8194（2013）18-0099-02