重组人角质细胞生长因子-1突变体表达载体的构建

赵 雪 麻馨月

（吉林农业科技学院，吉林 吉林，132101）

重组人角质细胞生长因子-1突变体表达载体的构建

赵 雪 麻馨月

（吉林农业科技学院，吉林 吉林，132101）

目的构建重组人角质细胞生长因子-1突变体的表达载体。方法采用PCR突变方法，将rhKGF cDNA第40位的Cys密码子突变为Ser密码子，所得的突变片断插入表达载体的表达框架中。结果DNA测序分别证实合成的基因序列克隆入pET-22b中。结论构建重组人角质细胞生长因子-1突变体的表达载体，得到突变体蛋白40位丝氨酸突变截短型角质细胞生长因子[Ser40]rhKGFdest-23。

重组人角质细胞生长因子；突变体

角质细胞生长因子（Keratinocyte Growth Factor）是成纤维细胞生长因子家族的一员，它通过与受体（KGFR）的结合，特异性地刺激上皮细胞的增殖，对皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤有修复作用，能减少放化疗所带来的副作用。KGF能特异性作用于上皮细胞，而不作用于成纤维细胞和内皮细胞。试验表明，KGF 能加速伤口的重新上皮化[1]、促进角膜上皮损伤修复[2-6]细胞的损伤[7]，且在烧伤、溃疡以及切割伤的修复和再生方面有显著作用[8，9]。而N端前23位氨基酸残基缺失后的截短型KGF（KGFdes1-23）具有更高的稳定性和活性。KGF是成纤维细胞生长因子-7的肝素结合性家族的一员[10]。

本试验中重组人角质细胞生长因子（rhKGF），是一种通过DNA重组技术在大肠杆菌生产的重组人源蛋白。为了增加蛋白质的稳定性，在去除了内源性角质细胞生长因子N-端的前23个氨基酸，但不影响KGF对上皮细胞的促有丝分裂活性基础上，对40位游离的半胱氨酸进行丝氨酸突变，以期获得稳定性更好，表达量更高的40位丝氨酸突变截短型角质细胞生长因子[Ser40]rhKGFdest-23突变体蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

限制性内切酶，DNA连接试剂盒，质粒小提试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，DNA Marker均购自Takara公司；Yeast Extract，Typton均购自OXOID；Pyrobest DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶NdeⅠ、BamHⅠ，T4DNA连接酶，Agarose购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；表达载体pET-22b，hKGF由暨南大学医药生物技术研究开发中心提供。

1.2 方法

1.2.1 rhKGF1dest23基因片段的合成

设计[Ser40]rhKGF1dest23的两端物，上游引物：5’-GGAATTCCATA TGAGCTATGATTAT-3’（划线部分为NdeⅠ酶切位点）；下游引物：5’-CGGGGATCCTTATCACGTAATGGCC-3’（划线部分为BamHⅠ酶切位点）。以pET22b-[Ser40]rhKGF1为模板扩增[Ser40]rhKGF1dest-23，经94 ℃变性3min进入循环，然后72℃延伸5min，反应产物经1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。把回收产物命名为[Ser40]rhKGFdest-23。它的5’端有NdeⅠ酶切位点，3’端有Bam HⅠ酶切位点。

1.2.2 重组表达制粒pET22b-[Ser40]rhKGFdest-23的构建

重组表达质粒pET22b-[Ser40]rhKGF1dest-23用NdeⅠ和BamHⅠ37℃双酶切4h，切胶回收后，在SolutionⅠ连接酶的作用下，16℃连接3h后转入感受态DH5α细胞中，转化菌涂布在含100mg/L Amp平板上，菌落PCR为阳性的克隆菌，测序。

1.2.3 阳性菌落的鉴定

酶切完毕后，用PCR Product Purification Kit V3.0进行回收。挑选几个经菌落PCR鉴定呈阳性的转化子，接种到5mL含100µg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养，50%甘油保种。取适量甘油菌测序，序列测定由上海生物工程有限公司完成。

2 结 果

2.1 [Ser40]hKGF1dest23DNA片段的合成，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约为440 bp的DNA片段(图1)，与预期DNA片段大小一致，表明已经成功获得[Ser40]rhKGF1dest23基因。

2.2 转化子的阳性鉴定

通过42℃热激法将pET22b-[Ser40]rhKGFdest-23重组质粒的构建和序列分析，连接产物转入感受态DH5α中，进行菌落PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约440 bp见[Ser40]rhKGF1dest23目地条带，与理论预期值大小基本一致（图2），表明已成功构建重组表达载体，重组表达质粒经北京三博远志生物工程有限公司测序，DNA序列分析确证已成功引入突变，结果与预期相符（图3）。

图1 上、下游引物及突变体[Ser40]rhKGFdest-23基因片段

图2 含[Ser40]rhKGF1dest23重组转化子的菌落PCR阳性鉴定

3 讨 论

图3 重组载体DNA序列分析

FGF家族对内皮细胞，成纤维细胞与上皮细胞具有促细胞增殖与分化的功能，而KGF专一性的与上皮细胞的FGFRIIIb型受体特异结合，所以安全性较好。根据《Protein Science》上的基因结构分析，知h-KGF的40位Cys暴露在分子的表面，易氧化，从而引起h-KGF蛋白质结构的不稳定。本实验通过将重组角质细胞生长因子-1暴露在分子表面，易引起蛋白不稳定的第40位半胱氨酸突变为丝氨酸，使其蛋白结构稳定。为下一步的突变体蛋白的稳定性研究奠定基础。

[1] Pierce GF,Yanagihara D,Klopchin K,et al.Stimulation of all epithelial elements during skin regeneration by keratinocyte growth factor [J].Exp Med,1994,179(3):831-840.

[2] 钱中武,龚向明.角质细胞生长因子促进角膜上皮损伤修复的研究[J].中华眼科杂志,1998,34(1):15-18.

[3] Jiro I,Kenji K.Growth factor: important in wound healing and maintenance of transparency of the cornea[J].Prog Retinal Eye Res,2000,19(1):113-129.

[4] 黄新强,宋思扬.角质细胞生长因子研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2001,28(4):459-462.

[5] Housley RM,Morris CF,Boyle W,et al.Keratinocyte growth factor induced proliferation of hepatocytes and epithelial cells throughout the rat gastrointestinal tract[J].Clin Invest,1994,94(2): 764-777.

[6] Mart I,Makar Y,Ferguso N,et al.Transfection with keratinocyte growth factor 1 cDNA with electroporation improves wound healing in an aged mouse model[J].J Surg Res,2004,21(2):320-321.

[7] 王小华,周舟,朱光旭等.角质细胞生长因子对肠上皮细胞辐射损伤的防护作用[J].第三军医大学学报,2000,22(8):713-716.

[8] Xia YP,Zhao Y,Marcus J,et al.Effects of keratinocyte growth factor on wound healing in an ischaemia- impairedrabbits ear model and scar formation[J].Pathol,1999,18(4):431-438.

[9] Smith PD,Polo M,Soler PM,et al.Efficacy of growth factors in the accelerated closure of interstices in explanted meshed human skin grafts[J].J Burn Care Rehabil,2000,21(1):5-9.

[10] Rubin JS,Bottaro DB,Chedid M,et al.Keratinocyte growth factor [J].Cell Biol Int.,1995,19(6):399-411.

Q507

B

1671-8194（2013）15-0091-02

吉林农业科技学院青年教师科研基金资助项目