熟制鲍鱼残留细菌的分离及16S r DNA鉴定

郑瑞生, 陈凉凉, 肖 熙

(1.泉州师范学院化学与生命科学学院,福建泉州 362002;2.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

鲍鱼营养丰富,味道鲜美,具有润肺、滋肾补虚等功效,深受广大消费者喜爱.但是对于鲜鲍的烹饪并非人人都会,而将其加工成方便、快捷、安全的即食鲍鱼既可以丰富鲍鱼的产品品种,又可以满足现代都市人的需求.但由于鲍鱼加工过程受热不均,杀菌不够彻底,容易导致烘制后的鲍鱼发生黑变、流汁、恶臭等现象,造成产品的腐败变质,缩短产品的保质期.有研究认为大多数情况下食品中只有部分微生物参与腐败过程[1].针对这种情况,在20世纪90年代中期Dalgaard明确提出了特定腐败菌(specific spoilage organism,SSO)的概念[2-3].在刚加工完产品的微生物菌群中特定腐败菌数量少,但这些特定腐败菌在贮藏过程中生长较其他微生物快,并且腐败活性增强[4].因此,研究熟制鲍鱼产品中残留的特定腐败菌,对于有针对性的采取控制措施,防止其发生腐败变质,保证产品的质量安全具有十分重要的意义.食品中微生物的分离鉴定通常依赖于各种各样的表型观察.但由于有些表型不典型可能会导致错误的结果[5].目前出现了许多基于分子生物学技术的快速而直接的检测微生物的方法,其中细菌的序列分析是目前较好的新方法之一,16SrDNA分子大小适中,有足够的遗传信息用于分类研究,因此在许多细菌分离鉴定上被广泛使用[6-7].

本文采用平板划线分离方法,对烘制后的鲍鱼中残留的主要细菌菌群进行分离,并通过菌落形态观察、革兰氏染色分析和16S rDNA序列比对的方法对其进行鉴定.从而为烘制鲍鱼加工过程中残留腐败菌的控制,延长产品货架期提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验原料

鲍鱼购于福州市水产品批发市场,重量在50 g左右的鲜活鲍鱼,加冰条件下运送至实验室.将鲜活鲍鱼进行开壳、取肉,洗净后选择鲍体饱满、大小一致、外膜透明、有鲍鱼固有气味的鲍鱼,沥水,放入超低温冰箱中进行单体快速冻结.选取冻结后鲍鱼进行解冻、清洗、沥干,用铝盘盛后放入100℃烘箱中进行烘制5 min,冷却装入无菌三角瓶中,并于24 h内分析该加工后的鲍鱼残留菌情况.

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉、葡萄糖、氯化钠、普通营养琼脂,均购于国药集团;酵母提取物,上海生物工程有限公司;革兰氏染色试剂盒,购于青岛高科园海博生物技术有限公司;d NTPs(4种脱氧核苷三磷酸)、10倍浓度的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)缓冲液(Mg2+Plus)、Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker均购于TaKaRa生物工程有限公司;Universal DNA Purification Kit,天根生化(北京)科技有限公司;Agarose 1-H,BBI生物科技有限公司;Agar A,波士顿生物技术(BBI)有限公司.溶菌酶(Lysozyme)(酶活＞22 800 U/mg)和蛋白酶K(Proteinase K)(酶活为30 U/mg)均购于BBI生物科技有限公司.

100 mmol/L Tris-HCl母液是取三羟甲基氨基甲烷(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane,Tris)12.1 g,溶于去离子水中,再用100 mmol/L盐酸调整pH值至8.0,定容至1 L,高压121℃灭菌30 min后备用.

100 mmol/L EDTA母液是取乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)29.2 g,溶于去离子水中,再用100 mmol/L氢氧化钠调整pH值至8.0,定容至1 L,高压121℃灭菌30 min后备用.

TE溶液是取100 mL Tris-HCl母液和10 mL EDTA母液用去离子水定容至1 L,高压121℃灭菌30 min后备用.

DNA提取缓冲液由100 mmol/L Tris-HCl母液(pH值8.0),100 mmol/L EDTA母液(pH值8.0),100 mmol/L磷酸钠,1.5 mol/L NaCl,质量浓度为1%的十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HTAB)组成,高压121℃灭菌30 min后备用.

1.2.2 主要仪器设备

AL-204型电子天平,特勒-托利多仪器(上海)有限公司;电热干燥箱,上海实验仪器总厂;CT-2000型高压灭菌锅,天津市超拓科贸有限公司;SW-CJ-1FB型超净工作台,苏净集团安泰公司;GSP-9160MBE型隔水式恒温培养箱,海博迅实业有限公司医疗设备厂;HZQ-F型全温振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;电动匀浆机,国华科技有限公司;Olympus BX51型光学显微镜;AG22331型 PCR扩增仪,德国 Eppendorf Hamburg公司;Tanon2500R型凝胶成像系统,Tanon科技上海有限公司;紫外反射透射仪,上海精科实业有限公司;SDC-6型恒温水浴锅,波新芝生物科技股份有限公司;D-YY-12型电脑三恒多用电泳仪,北京六一仪器厂;Lx-100型手掌型离心机,江苏海门市麒麟医用仪器厂;UB-7型酸度计,ENVER INSTRUMENT公司;微量移液器(10,100,200,1 000μL),德国Eppendorf Hamburg公司;GL-20G-H型冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂;H1650-W型台式高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;ND-1000型核酸测定仪,美国Nano Drop公司.

2 实验方法

2.1 主要残留菌的分离纯化与初步鉴定

取熟制后的鲍鱼10 g,放入灭菌后的生理盐水100 mL中,于20℃条件下进行振荡摇匀,至肉汤明显混浊,取1 mL肉汤,用10倍递增法进一步制成1×10-2,1×10-3,1×10-4和1×10-5等体积分数的稀释液,取 100μL稀释体积分数为 1×10-3,1×10-4和1×10-5的稀释液涂布营养琼脂平板(含0.5%葡萄糖)进行培养,挑取菌落数在30～300个左右的平板,对典型的单菌落反复进行划线分离、纯化.共筛选出52株,将分离纯化后的单菌落放置于35℃培养箱中(该温度条件下有利于嗜中温性海洋细菌生长,同时可防止温度过高导致培养基水分散失较多,边缘发生干裂),培养24 h后进行菌落观察,包括菌落的大小、形态、颜色、隆起度、边缘结构、表面形态、光泽度、透明度及质地等.同时挑取长势好的单一菌落,对其进行革兰氏染色及芽孢染色,并在显微镜下观察.

2.2 鲍鱼残留细菌的总DNA提取及PCR扩增

2.2.1 鲍鱼残留细菌总DNA的提取

挑取经分离纯化后的菌样数环,置于20 mL灭菌后的营养肉汤中(含0.5%葡萄糖),于35℃条件下进行振荡扩大培养24 h,至菌液明显混浊(说明微生物大量生长).取上述菌液1 mL,12 000 r/min室温离心5 min,弃上清得菌体沉淀,再加入1 mL TE溶液,充分震荡使菌体悬浮,加入200μL溶菌酶(10 mg/L)37℃水浴30 min,再加入3 mL DNA提取缓冲液和20μL蛋白酶K(20 mg/mL),混匀后于65℃下水浴1 h,期间每20 min中放入-80℃超低温冰箱冻融10 min,重复3次.

冻融完毕后,加入等体积的Tris饱和酚-氯仿-异戊醇混合溶液(V(Tris饱和酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)=25∶24∶1),轻轻混匀,常温 12 000 r/min 离心10 min,小心吸取上层溶液于另一离心管中,溶液再用等体积的氯仿-异戊醇混合溶液(V(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1)抽提一次,之后加入0.6倍体积的预冷的异丙醇,4℃静置沉淀1 h后,4℃ 12 000 r/min离心10 min,弃上清,沉淀用1 mL 70%的乙醇(含0.1 mol/L,醋酸钠)重复洗涤2～3次,沉淀于超净台下吹干,以去除残留的乙醇.最后沉淀溶解于50μL的TE中.1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA完整性,并进行DNA浓度的测定.

2.2.2 PCR扩增

以2.2.1提取的 DNA作为模板,进行 PCR扩增.

1) 反应引物：引物 1(27F)：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′;引物 2(1492R)：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.

2)反应体系(50μL)：25μL的反应体系中含有10倍PCR缓冲液(Mg2+Plus)2.5μL、dNTP(2.5 mmol/L)2.0μL、适度稀释的模板DNA(约10 ng)1 μL、Taq酶(2.5 U/μL)0.4 μL、引物 1 和引物 2 各0.5μL(10 pmol/L)、重蒸水18.1μL.

3)反应条件：PCR扩增条件为94℃预变性5 min,94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸90 s,35个循环后,72℃延伸10 min.

2.2.3 PCR产物测序

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化,由上海生工生物工程有限公司进行测序.将拼接后的测序结果输入 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast,利用BLAST软件,将测定得到的基因序列与Genbank数据库进行序列比对分析,进行同源相似性比较.

3 结果与讨论

3.1 残留细菌分离及染色结果

从熟制鲍鱼中挑取具有典型菌落形态特征的残留菌52株.根据菌落形态、革兰氏染色,及芽孢染色结果对其进行初步分类,其中典型的主要残留细菌有7株,其编号及菌落形态、革兰氏染色结果、形态特征描述分别见图1、图2及表1.

3.2 16S r DNA基因同源性分析结果

3.2.1 PCR扩增产物

分别提取7株菌的基因组DNA后,利用PCR扩增其16SrDNA基因片段,取PCR产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳分析,如图3.各样品都在1 500 bp处出现明显条带,说明供试菌株的16S rDNA基因扩增成功.

3.2.2 PCR产物测序及菌株鉴定

测定残留细菌的16S rDNA全序列,分析其同源性,明确各种菌的种属类别.将获得的有效序列提交到NCBI,通过Blast程序与GenBank数据库中已知序列进行相似性比对(http：∥ncbi.nlm.nih.gov/blast).PCR产物经纯化后,进行核苷酸序列分析,结果见表2.

图1 主要残留菌平板菌落特征Fig.1 Characteristics of main residual bacteria colonies

图2 主要残留菌革兰氏染色Fig.2 Gram staining of main residual bacteria

表1 主要残留菌的形态特征Tab.1 Morphological characteristics of main residual bacteria

表2 主要残留菌的鉴定结果Tab.2 Identification results of main residual bacteria

由表2可知,分离到的细菌序列与Genbank中最接近细菌的同源性达到99%,最终确定这些细菌分别为：希瓦氏菌属(Shewanella sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、库特氏杆菌属(Kurthia sp.)、海洋类香菌(Myroides pelagicus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、彭氏变形杆菌(Proteus penneri)等,各自在残留细菌中所占比例分别为21.15%(11株)、21.15%(11株)、17.31%(9株)、17.31%(9 株)、9.62%(5 株)、9.62%(5株)、3.85%(2株).由此可见,希瓦氏菌属、不动杆菌属是烘制鲍鱼中主要的残留细菌.

图3 主要残留菌的16SrDNA的PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoretic graph of 16SrDNA amplified from main residual bacteria

4 结 论

本研究从烘制鲍鱼中分离出的残留细菌,经过菌落形态观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析后,鉴定其分别为希瓦氏菌属(Shewanella sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、库特氏杆菌属(Kurthia sp.)、海洋类香菌(Myroides pelagicus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、彭氏变形杆菌(Proteus penneri)等,其在残留的细菌中所占比例分别为21.15%,21.15%,17.31%,17.31%,9.62%,9.62%,3.85%.其中希瓦氏菌属、不动杆菌属、蜡样芽孢杆菌、肠杆菌属及彭氏变形杆菌为常见的腐败菌,而库特氏杆菌属、海洋类香菌较为少见.希瓦氏菌属、不动杆菌属又是烘制鲍鱼中主要的残留细菌.

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