60 Co-γ同剂量辐照对明胶特性的影响

耿胜荣, 廖 涛, 李 新, 鉏晓艳

(湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所/湖北省农产品辐照加工中心/湖北省农业科技创新中心,湖北武汉 430064)

辐照是一种利用电离射线与物质作用,产生的物理、化学和生物学效应,达到杀虫灭菌的目的[1].射线的穿透力强和冷杀菌两个优点,尤其适合组织材料、医药和医疗用品上的消毒灭菌[2-4],保证生物安全性和延长货架期.目前辐照作为明胶和胶囊灭菌应用已十分广泛.但是辐照过程中常常产生负效应导致明胶黏度下降、胶囊易碎、溶胀性差的问题.目前关于明胶品质劣变的研究在明胶可溶性变差,导致药品胶囊的药物溶出率低[5],明胶膜的交联改性[6]方面有报道,但胶囊或明胶本身在原料阶段辐射灭菌引起的品质变化缺乏研究.本实验以小分子量进口明胶为材料,开展辐照对明胶理化性能与蛋白成分(分子量、分子组成及结构等)的影响,探索剂量与分子量大小、分布和性能的关系,为确定最佳辐射剂量提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

G9382型牛皮明胶,Simga公司生产.

1.2 仪器设备

60Co-γ辐照源,湖北省辐照实验中心;1515型高效液相色谱泵、2690D型分离模块、2410型折射率检测器、Ultrahy drogel 2000,250型色谱柱,美国waters公司;Quanta 200型扫描电镜,荷兰FEI公司;DSC200F3型示差扫描量热仪,德国Netzsch公司;TA-XTPlus型质构仪,英国SMS公司;DYY-12型电泳仪,北京六一仪器厂,50 mL稀释型乌氏黏度计等.

1.3 辐照处理

明胶用自封口袋包装,采用动态悬挂辐照的方式分别照射4～52 kGy,每个剂量样品附有两支硫酸亚铁剂量计跟踪剂量,平均值作为样品的吸收剂量.对照不辐照.照射完后立即取样测定各指标.

1.4 测定方法

1.4.1 特性黏度的测定

取0.6 g明胶,加入11.4 g蒸馏水,室温溶胀,55℃水浴溶解,配制成初始浓度(c0)为5%的明胶水溶液.此后用蒸馏水逐次稀释成原浓度的2/3,1/2,1/3和1/4.用0.45 mm乌氏黏度计在37℃下测定不同浓度(c)的样品流出两刻度线的时间(t)和蒸馏水流出时间(t0),计算特性黏度[η].

1.4.2 凝胶强度的测定

在文献[7]的基础上进行改进,质构仪测定参数按美国试验标准GMIA进行.

1.4.3 熔化温度及胶凝温度的测定

在文献[8]的基础上进行改进.示差扫描量热仪的温度程序：10～55℃,升温速度5℃/min;55℃恒温2min;55～10℃,降温速度5℃/min,5℃恒温2min,65℃结束.

1.4.4 分子量大小及分布的测定

在文献[9]的基础上进行改进.配制1 000 mL的0.1 mol·dm-3Na2HPO4,其中含8 g NaN3,用 NaH2PO4调节pH至8.0,取500 mL作为储备液.另取500 mL储备液稀释至2 000 mL作为淋洗液;进样量为100 μL,溶剂为 H2O-0.2 mol·dm-3NaNO3,淋洗液流速为0.6 mL/min.标样为聚乙烯乙二醇,柱子温度40℃,检测器温度40℃.

1.4.5 蛋白组分分布的测定

聚丙烯酰胺凝胶电泳采用15%分离胶和4%浓缩胶,样品浓度为2 mg/mL,上样量为20μL.浓缩胶电压为60 V,分离胶电压为100 V.考马斯亮蓝R250染色过夜,用脱色液脱色3次.脱色后的胶块照相保存.

1.4.6 表面形貌分析的测定

采用扫描电镜进行分析.配制未照射和照射52.7 kGy的明胶10%的水溶液各100 mL,低温下形成凝胶后,在-80℃冰箱速冻,再冻干,取少量冻干样品做表面和截面扫描.

2 结果与分析

2.1 辐照对明胶黏度的影响

未辐照明胶的特性黏度和相对黏度分别为2 936 mL/g和2.52,辐照后明胶两种黏度随剂量的增加快速下降(见图1).吸收剂量为8.01 kGy的明胶特性黏度和相对黏度分别为对照的93.3%和96.4%,吸收剂量为26.79 kGy的明胶分别为对照的84.2%和92.1%.可见,生产上常用的8 kGy的灭菌剂量,辐照后明胶水溶液的表观黏度略有下降,当吸收剂量达到26.79 kGy时,应用品质受到影响.特性黏度的下降来源于分子的降解,辐射剂量越大,降解程度越大.

2.2 辐照对明胶凝胶强度的影响

图1 辐射剂量对特性黏度和相对黏度的影响Fig.1 Effect of irradiation dosage on intrinsic viscosity and relative viscosity

未辐照的明胶凝胶强度为141 g,辐照后的明胶凝胶强度有小幅波动,总趋势为下降的(见图2).吸收剂量为8.01 kGy时,凝胶强度为153.6 g,较对照有所增加.当吸收剂量为26.79 kGy时,凝胶强度为100 g,为对照的70.9%.据报道,明胶中的α组分与凝胶强度成正比[10-11].由此可见,辐照降低了明胶中α组分含量,剂量越大,降解程度越大.

图2 辐射剂量对凝胶强度的影响Fig.2 Effect of irradiation dosage on gel strength

2.3 辐照对明胶熔化和胶凝温度的影响

明胶是一种热可逆凝胶,稳定这种热可逆凝胶网络结构的主要作用力是氢键.当温度升高,分子链热运动加强,氢键断开,凝胶网络结构被破坏.当温度降低,熔胶体系自发放热形成凝胶.明胶水溶液熔胶-凝胶转变临界温度点称为胶凝温度和熔化温度[9].图3为不同辐照剂量明胶熔胶和凝胶温度变化曲线图,可见,未辐照明胶熔胶温度为27.1℃,辐照后明胶的熔胶温度随剂量呈下降趋势.未辐照明胶凝胶温度为36.2℃,辐照后明胶的凝胶温度高于对照,范围在39.8～42.7℃.吸收剂量低于8.01 kGy时,明胶胶凝温度有小的上升峰,吸收剂量大于8.01 kGy时,明胶胶凝温度随剂量的增加呈缓慢上升趋势.辐照引起明胶的熔胶温度下降,这说明分子吸热解链热能降低,明胶网络结构对热不稳定,分子发生了分解.辐照引起胶凝温度升高,说明分子自发形成网络结构容易,分子发生了降解.

图3 辐射剂量对明胶熔化温度和胶凝温度的影响Fig.3 Effect of irradiation dosage on melting point and gel point of gelatin

2.4 辐照对明胶分子量的影响

图4 为不同剂量辐照后明胶相对重均分子量Mw和相对数均分子量Mn的变化曲线图.未辐照的明胶的Mw和Mn分别为36 506和10 861.二者在0～8.01 kGy范围的吸收剂量有小的上升峰,此后,均随剂量的增加呈下降趋势,吸收剂量达到52.7时,二者分别为对照的88.87%和72.18%.这说明,辐照将大分子降解,形成更多种小分子的混合物,剂量越大,降解程度越大,分子量越低.

图4 辐射剂量对明胶分子量的影响Fig.4 Effect of irradiation dosage on Mw and Mn of gelatin

图5 为不同剂量辐照明胶的凝胶渗透色谱图.未辐照明胶(0 kGy)出峰早,峰型高而窄.辐照后明胶出峰晚,峰型矮而宽,并且剂量越大,峰型越宽而矮.这说明分子量的分布随剂量增加而加大.

2.5 SDS-PAGE分析

图5 不同剂量辐照后明胶的凝胶渗透色谱图Fig.5 Molecular weight and distribution of irradiated gelatin

图6 为0～52.7 kGy辐照明胶的电泳图.左边第1个泳道为未辐照明胶,分子量主要分布在5 500 u以上,在3 600 u以下几乎不含有蛋白组分.辐射剂量逐渐加大,泳道颜色变浅,这说明明胶蛋白各组分在辐照过程中发生了分解反应,大分子量物质含量降低.辐照剂量高于37.91 kGy时,大于25 000 u的物质明显减少,分子量主要分布在25 000～13 000 u,低于3 600 u的小分子含量有少量增加.

图6 不同剂量辐照后明胶的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of gelatin irradiated by different dosage

2.6 结构分析

明胶先在水中溶胀,再冻干做扫描分析.图7a、7b分别是未辐照和辐照52.7 kGy明胶放大2 500倍表面图.前者表面看到有颗粒,而后者表面光滑,成膜性好.这是因为经辐照52.7 kGy后,溶胀性差的大分子降解为溶胀性较好的小分子,溶胀后分子排列更整齐,表面更光滑.

图7 未辐照和辐照52.75 kGy明胶表面SEM图Fig.7 SEM sperm of gelatin no irradiated(a)and irradiated by 52.7 kGy(b)

3 结 论

明胶辐射杀菌的同时常导致溶液黏度、凝胶弹性以及成膜性等品质下降的问题,很大程度影响了其应用价值.从本研究结果来看,0～52.7 kGy辐照范围,由于辐射分解,明胶分子网络结构降解,大分子量物质含量下降,小分子量物质含量增加,平均分子量下降,Mn和Mw范围为7 839～10 861,32 444～36 506.并且分子量分布变宽,范围为3.36～4.45.特性黏度和相对黏度降低、凝胶强度降低、熔胶温度下降和胶凝温度升高、表面结构更为平滑和整齐.

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